魏昕鈺,李明虓,張靈倩,趙 陽,黃成軍

(1.中國科學(xué)院微電子研究所 健康電子研發(fā)中心,北京 100029;2.中國科學(xué)院大學(xué) 電子信息與技術(shù)學(xué)院,北京 100029)

0 引 言

肺癌疾病的早期篩查對于此類疾病的治療具有重要意義[1]。生物學(xué)研究表明細胞的異常代謝氣體會溶于血液,通過呼吸作用排出體外。因此,對呼吸氣體的檢測結(jié)果可反映潛在病變細胞的新陳代謝水平,應(yīng)用于癌癥,尤其是肺癌的篩查和診斷[2]。目前已發(fā)現(xiàn)超過196種代謝氣體與肺癌疾病相關(guān)[3],然而這種方法缺乏理論研究和數(shù)據(jù)支持,難以用于臨床治療。因此,在細胞級別進行實驗驗證和數(shù)據(jù)支持是十分必要的。

微流控芯片具有集成度高,樣品消耗少等優(yōu)點[4]。微通道尺寸與體內(nèi)尺寸相當(dāng),可進行細胞三維培養(yǎng)和生物微環(huán)境模擬,構(gòu)建與細胞尺度匹配的三維空間,模擬體內(nèi)細胞的生長狀況,真實地反映其生物學(xué)特征,為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面的研究提供一個新思路。

本文提出了一種結(jié)構(gòu)簡單、反應(yīng)靈敏的肺泡芯片。該芯片由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)微通道和聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)核孔膜組成,可實現(xiàn)肺癌細胞的三維培養(yǎng)和醛類代謝氣體的捕獲,為呼吸檢測方法提供理論支持。

1 芯片制備

1.1 結(jié)構(gòu)設(shè)計與制備

1.1.1 結(jié)構(gòu)設(shè)計

考慮到肺泡尺寸和肺部的氣血屏障結(jié)構(gòu)[5],肺泡微流控芯片由兩層結(jié)構(gòu)化PDMS(30 mm×15 mm×2 mm)和一層PET核孔膜(15 mm×5 mm×5 μm,孔徑5 μm)組成,分層示意圖如圖1所示。

圖1 肺泡芯片分層結(jié)構(gòu)示意

1.1.2 芯片制備

PDMS結(jié)構(gòu)采用軟光刻方法翻膜得到,模具為硅基結(jié)構(gòu)。首先設(shè)計微通道版圖,制作掩模版。之后,通過光刻、刻蝕等工藝進行硅基圖形化。將PDMS預(yù)聚物和固化劑以10︰1的體積比充分混合,澆入硅基結(jié)構(gòu),在80 ℃下烘烤固化3 h,之后脫模切割,用直徑3 mm的打孔器在兩端打孔,作為細胞懸液和培養(yǎng)基等液體的出入口。PDMS內(nèi)部微通道的深度為100 μm,寬度為500 μm,長度為15 mm,體積為7.5 μL(制作工藝如圖2(a)所示)。PET核孔膜通過重離子打孔和化學(xué)擴孔的工藝方法產(chǎn)生[6],如圖2(b)所示,膜上有致密的小孔,每個小孔的形狀和尺寸基本相同,孔徑為7 μm。

PDMS-PET層間鍵和采用化學(xué)浸泡法[7]和表面氧等離子體處理相結(jié)合的方法,用到的化學(xué)試劑為GLYMO 和 APTES兩種硅烷偶聯(lián)劑。具體的處理方法為：1)首先,用去離子水分別配制1 %濃度的GLYMO溶液和5 %濃度的APTES溶液；2)將PDMS和PET分別放入1 %的GLYMO溶液中和5 %的APTES溶液中,各浸泡20 min；之后用去離子水沖洗后吹干；3)將PDMS和PET的鍵合面向上,放入等離子體腔室中,進行氧等離子體表面處理,功率設(shè)置為中檔,注氧90 s,取出后對準(zhǔn)鍵合到一起,完成芯片制作。得到最終的芯片實物如圖2(c)所示。

圖2 肺泡芯片的制備

1.2 表面改性

1.2.1 化學(xué)改性原理

為完成代謝氣體的片內(nèi)捕獲,這里使用氨氧基季銨鹽—乙醇溶液完成PDMS化學(xué)改性,化學(xué)方程式為H2NO-Z-N+/A-,其中Z是連接基團,可以取代芳基、烷基或者醚類基團,A可以是任意一種鹵族元素,如氯、溴、碘等。該分子一端的—ONH2基團可以快速與細胞代謝產(chǎn)生的羰基化合物發(fā)生肟化反應(yīng),得到醛肟或酮肟分子[8],其可通過質(zhì)譜檢測方法識別。肟化反應(yīng)結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 化學(xué)改性反應(yīng)式

1.2.2 改性處理方法

使用氨氧基季銨鹽對PDMS通道進行化學(xué)改性處理,改性物質(zhì)化學(xué)名稱為2—氨氧乙基季甲銨碘鹽 (ATM),化學(xué)式如圖3所示。具體改性方法為：1)使用無水乙醇稀釋氨氧基鹽溶液,制備濃度為4 mmol/L的改性試劑；2)滴加10 μL改性試劑到PDMS微通道表面；3)待乙醇溶劑揮發(fā)后改性物質(zhì)存留在通道表面,完成PDMS的表面修飾。

2 細胞實驗

2.1 細胞培養(yǎng)

首先配制實驗中使用的培養(yǎng)基溶液。由于PDMS通道狹長,和傳統(tǒng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞的環(huán)境相比更具挑戰(zhàn)性,因此增加培養(yǎng)基中FBS(胎牛血清)的比例,促進細胞的生長代謝,實驗結(jié)果證明細胞的貼壁和生長狀態(tài)較好。具體培養(yǎng)基配制方法為RPMI 1640︰FBS︰雙抗=100︰20︰1。

之后進行微流控肺泡芯片的預(yù)處理,將鍵合好的芯片紫外照射30 min以上,之后用大量磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗通道,排出溝道內(nèi)氣泡；然后用去離子水配制20 mg/mL的人纖連蛋白溶液緩緩注入通道內(nèi),放入細胞培養(yǎng)箱(37 ℃,5 %濃度CO2)3 h以上；取出芯片后,使用培養(yǎng)基溶液沖洗通道,將混合均勻的,密度在106/mL的肺癌細胞(A549)懸液注入下層通道,培養(yǎng)1天左右,在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁形態(tài)和增殖情況。

2.2 代謝氣體檢測

2.2.1 質(zhì)譜檢測方法

質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)分析利用電場和磁場將運動的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測,通過分析這些粒子可獲得化合物的分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息。實驗中使用的質(zhì)譜檢測儀器為Orbitrap Fusion LUMOs,它具有可自動進樣、電場/磁場雙模式及檢測精度高的優(yōu)勢。

如圖4所示是一次實驗測得的質(zhì)譜圖,設(shè)置FTMS-pESI模式(p代表positive,正離子模式),自動進樣1 μL。圖中得到每個峰代表一種化合物,其中,質(zhì)荷比m/z=119.12代表原始的改性物質(zhì)(ATM),m/z=131.12代表改性物質(zhì)捕獲到的甲醛氣體(CH2O),m/z=145.13代表捕獲到的乙醛氣體(C2H4O),m/z=159.15代表捕獲到的丙酮氣體(C3H6O),m/z=173.17代表捕獲到的2—丁酮氣體(C4H8O),物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)由氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)得到[9]。通過觀察混合溶液中每一種化合物的峰值強度,可以得知各種化合物在混合溶液中的相對含量,以及不同控制變量下各種物質(zhì)的變化。

圖4 洗脫后的細胞代謝氣體羰基化學(xué)物質(zhì)譜圖

2.2.2 實驗組測試

每12 h為溝道內(nèi)的細胞更換培養(yǎng)基,確保細胞在溝道內(nèi)有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。細胞代謝氣體經(jīng)過微孔膜與改性區(qū)域充分接觸。一天以后取下上層改性PDMS,使用無水甲醇進行洗脫富集,得到50 μL左右的反應(yīng)后溶液,將溶液進行有機質(zhì)譜檢測,確定其反應(yīng)后成分。

2.2.3 實驗說明

實驗中使用的PET核孔膜購自武威科近新發(fā)技術(shù)有限責(zé)任公司,細胞培養(yǎng)相關(guān)溶液購自ThermoFisher,化學(xué)改性相關(guān)的試劑和溶液購自Sigma-Aldrich,基于肟化反應(yīng)的改性試劑由已公開的方法[10]合成,PDMS預(yù)聚物及其固化劑(SYLGARD 184)購自TORAY(日本),其他實驗中用到的儀器包括倒置顯微鏡(CX41 OLYMPUS),細胞培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC),生物安全柜(BIOBASE BSC—1100),等離子體清洗機(HARRICK PLASMA),水浴鍋(KEWEI)。

3 結(jié)果與討論

3.1 改性物質(zhì)在PDMS溝道內(nèi)的氣體捕獲效果

在微孔膜上進行細胞培養(yǎng)后,細胞代謝過程中產(chǎn)生的羰基化合物可與改性物質(zhì)結(jié)合,起到代謝氣體捕獲的作用,氣體捕獲后的PDMS改性區(qū)域的顯微鏡圖片如圖5所示 。

圖5 改性區(qū)域捕獲氣體后顯微鏡圖

3.2 細胞在PDMS溝道內(nèi)的生長特性

實驗中使用熒光染料確定通道內(nèi)細胞的生長情況：將10 μL Calcein-AM(2 μmol/L )和400 μL PI(16 μg/mL )加入4 590 μL PBS溶液里混合均勻,配制成Calcein-AM/PI(Propidium Iodide)細胞雙染試劑,在熒光顯微鏡下同時觀察PDMS通道里的活細胞和死細胞。Calcein-AM可透過細胞膜,通過活細胞內(nèi)的酯酶作用脫去AM基團,產(chǎn)生的Calcein(鈣黃綠素)發(fā)出強綠色熒光,因此活細胞在熒光顯微鏡下可被檢測到綠色熒光。另一方面PI通過受損的細胞膜進入到死細胞內(nèi)并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光,因此死細胞會被檢測到紅色熒光。

如圖6所示,細胞在通道內(nèi)正常貼壁,形態(tài)良好,可以持續(xù)保持細胞活性,染色后發(fā)現(xiàn)活細胞數(shù)量較多,死細胞數(shù)量很少,證明了微流控芯片可以較好地模擬細胞生長環(huán)境,維持細胞代謝水平。

圖6 細胞在微通道內(nèi)貼壁生長情況

3.3 實驗工藝和細胞培養(yǎng)對質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響評估

在開始肺泡芯片的實驗前,進行了對照組實驗,測試在化學(xué)改性時,PDMS材料本身、表面氧等離子體處理、以及培養(yǎng)基對氣體檢測結(jié)果的影響。如圖7所示,對照組為改性試劑的質(zhì)譜檢測結(jié)果,PDMS組為將改性試劑滴加在PDMS之后重新富集的質(zhì)譜結(jié)果,等離子體組為將PDMS注氧后滴加改性試劑再富集,而培養(yǎng)基組為將改性試劑混合少量培養(yǎng)基(≈2 μL)之后進行質(zhì)譜分析。

圖7 三組變量實驗結(jié)果

觀察質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn),這三組實驗變量的結(jié)果與空白對照組類似,三種氣體成分的變化在實驗誤差允許的范圍內(nèi),證明PDMS材料本身,表面氧等離子體處理方法,以及培養(yǎng)基成分對實驗結(jié)果的影響較小,在實驗中可以正常使用。

3.4 細胞代謝氣體捕獲成分分析

統(tǒng)計每次實驗組中捕獲的各羰基化合物成分的濃度含量,與對照組進行對比,觀察4種羰基化合物成分的變化,做出它們的含量增值部分曲線,如圖8所示。圖中可觀察到4種氣體含量均有所增加,氣體量級在0～80 μmol,其中丙酮氣體增加最顯著,甲醛和乙醛氣體也有明顯增多。而分析對照組的質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)其中并未存在2—丁酮氣體,證明細胞代謝過程也會產(chǎn)生少許2—丁酮。

圖8 代謝氣體分析

相關(guān)生物學(xué)研究表明,肺癌會誘導(dǎo)氧化酶的生成并帶來“氧化應(yīng)激”,即機體活性氧成分與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng),這會引起特定揮發(fā)性代謝產(chǎn)物濃度的增高[11]。而羰基化合物氣體常在機體內(nèi)生化反應(yīng)過程中以中間產(chǎn)物形式生成,一些羰基化合物在給定的反應(yīng)中具有特異性,例如脂質(zhì)氧化會生成自由基。在本次實驗中,通過將微流控芯片與化學(xué)捕獲方法結(jié)合,本文進行了四種羰基標(biāo)志物氣體在肺癌細胞代謝過程中的識別,結(jié)果表明肺癌細胞的生長代謝過程會生成較多的丙酮氣體、甲醛和乙醛氣體以及少量的2—丁酮氣體。

4 結(jié) 論

介紹了一種用于細胞代謝氣體捕獲的微流控肺癌芯片,可進行細胞的片上培養(yǎng)和醛類代謝氣體的識別。文中使用肺癌細胞(A549)進行實驗,芯片可以較好地完成細胞培養(yǎng)和氣體捕獲的功能,證明了芯片功能的有效性,為細胞代謝氣體的分析提供了一種有效的途徑,為呼吸檢測在肺癌疾病的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。