侯靜芳，楊華，王進(jìn)海

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，陜西 西安 710004；2.西安市第一醫(yī)院老年消化科，陜西 西安 710002

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生于胃黏膜上皮，幽門螺桿菌(Hp)感染是該病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，據(jù)數(shù)據(jù)顯示，約有60%的胃癌患者合并Hp感染[1]。幽門螺桿菌L型(Hp-L)是Hp的一種變異類型，擁有更強(qiáng)大的致癌作用，也是導(dǎo)致胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因素，可明顯加劇病情惡化速度[2]。早期了解胃癌患者Hp-L感染發(fā)生的危險(xiǎn)因素在判斷病情嚴(yán)重程度、指導(dǎo)治療方面有重要意義。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(ΜIF)在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展方面作用關(guān)鍵，參與著正常細(xì)胞的分裂、癌基因所誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化過程[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(ΜΜP-9)對(duì)基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)中的IV型膠原具有降解作用，可促進(jìn)新生血管生成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為重要的促內(nèi)皮細(xì)胞分裂、促血管生成因子，參與著腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[4]。此外，胃黏膜炎癥在胃癌的惡化過程中也占據(jù)著重要地位，炎癥反應(yīng)越重則可能提示Hp感染程度越重[5]。因此，本研究通過觀察ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子在胃癌合并Hp-L感染患者中的表達(dá)水平，并探討其臨床意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2月至2019年2月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的172例胃癌患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并通過組織病理學(xué)檢查確診[6]；②具有胃癌組織標(biāo)本以及距離癌組織邊緣＞5 cm的正常胃黏膜組織標(biāo)本；③初次接受診斷確診，既往未接受過相關(guān)抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月內(nèi)使用過質(zhì)子泵抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗Hp感染治療等；②合并其余急慢性感染性疾?。虎酆喜⒊鲅约膊。虎芎喜⑵溆鄲盒阅[瘤或者重大軀體疾?。虎萑焉锲诓溉槠?。172例患者中男性101例，女性71例；年齡43～76歲，平均(63.40±7.52)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情并簽署同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 Hp-L感染檢測(cè) 將胃癌組織、癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，結(jié)晶紫初染30 s，洗滌，碘液復(fù)染1 min后，視野95%乙醇脫色，時(shí)間30 s，再次洗滌，稀釋，復(fù)紅復(fù)染，時(shí)間2 min；再次洗滌，使用中性樹膠予以封片，革蘭染色油鏡下觀察，放大倍數(shù)10×100，隨機(jī)觀察10～15個(gè)不同的視野并計(jì)算數(shù)量，最終結(jié)果取平均數(shù)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌L型、Hp均數(shù)≥20，陰性標(biāo)準(zhǔn)為＜20或者無L型和Hp陰性[7]；并進(jìn)行免疫組化(SP)染色，工作濃度1∶80，將磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為陰性對(duì)照，已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，抗Hp-L抗體購(gòu)于蚌埠醫(yī)學(xué)院微生物教研室；觀察顯示胃癌細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或者胞膜中有棕黃色顆粒表達(dá)，則判定為Hp-L陽(yáng)性；當(dāng)革蘭染色、SP染色檢查結(jié)果均顯示為陽(yáng)性，則最終判定為Hp-L感染[7]。

Hp-L感染程度的判定方式[7]：在顯微鏡下，對(duì)胃黏膜黏液層、小凹上皮、表面上皮、腺管上皮表面的L型和Hp情況進(jìn)行觀察，輕度為：L型和Hp表達(dá)少量，僅偶爾發(fā)現(xiàn)或者不到標(biāo)本組織長(zhǎng)度的30%；中度：L型和Hp的表達(dá)呈連續(xù)、稀薄性，在上皮表面有分布，或者到達(dá)標(biāo)本組織長(zhǎng)度的31%～60%；重度：L型和Hp的表達(dá)量多，已到達(dá)標(biāo)本組織長(zhǎng)度的60%以上。

1.2.2 ΜIF、ΜΜP-9、VEGF檢測(cè) ΜΜP-9、抗ΜIF、VEGF單克隆抗體均由武漢博士德公司提供，SP試劑盒由福州邁新該公司提供；采用免疫組化法檢測(cè)ΜIF、ΜΜP-9、VEGF陽(yáng)性率情況，具體方式如下：將切除的胃癌組織、癌旁組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行4μm連續(xù)性切片，SP試劑盒染色，使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行煮沸修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，再使用蘇木素復(fù)染，將PBS作為陰性對(duì)照，已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照；ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的表達(dá)均定位在細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)類的染色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，染色強(qiáng)度無染色則記0分、淡黃色則記1分、棕黃色則記2分、棕褐色則記3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量＜5%則記0分、5%～25%則記1分、26%～50%則記2分、＞50%則記3分，將兩者結(jié)果相加，總分≥3分則判斷為陽(yáng)性，＜3分則判斷為陰性[7]。

1.2.3 血清炎癥因子檢測(cè) 收集所有患者清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h后上離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時(shí)間10 min，提取上層清液儲(chǔ)存于-80℃的冷凍箱中待檢。檢測(cè)指標(biāo)包括白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β，試劑盒均購(gòu)于深圳晶美生物工程有限公司。檢測(cè)方式如下：使用IL-6、IL-1β抗體包被酶標(biāo)板，洗去游離部分后，加入經(jīng)過辣根過氧化物酶(HRP)所標(biāo)記的抗人IL-6、IL-1β抗體，洗去游離部分，加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TΜB)進(jìn)行顯色，在HRP的催化下，TΜB顯示出藍(lán)色后，加入終止液，使用酶標(biāo)儀對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算血清IL-6、IL-1β濃度的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中Hp-L感染陽(yáng)性率比較 胃癌組織中Hp-L感染陽(yáng)性率為69.19%，明顯高于癌旁組織的12.21%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=115.678，P＜0.05)。

2.2 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性和陰性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率比較 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Hp-L陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性和陰性患者的MIF、MMP-9、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率比較(例)

2.3 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性和陰性患者血清炎癥因子比較 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性患者血清IL-6、IL-1β的表達(dá)水平明顯高于Hp-L陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性和陰性患者血清炎癥因子比較(±s，pg/mL)

表2 胃癌Hp-L感染陽(yáng)性和陰性患者血清炎癥因子比較(±s，pg/mL)

組別Hp-L感染陽(yáng)性Hp-L感染陰性t值P值例數(shù)119 53 IL-1β 28.31±3.42 14.07±2.31 27.614＜0.05 IL-6 25.05±3.71 16.23±2.04 16.232＜0.05

2.4 不同Hp-L感染程度患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子表達(dá)水平比較 119例Hp-L陽(yáng)性感染患者中輕度感染27例，中度感染56例，重度感染36例。重度感染患者的ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率及血清IL-6、IL-1β水平明顯高于中度和輕度感染患者，中度感染患者上述結(jié)果均明顯高于輕度感染患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同Hp-L感染程度患者M(jìn)IF、MMP-9、VEGF及炎癥因子表達(dá)水平比較

2.5 Hp-L感染陽(yáng)性與ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子水平的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hp-L感染陽(yáng)性與ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表4。

表4 Hp-L感染陽(yáng)性與MIF、MMP-9、VEGF及炎癥因子水平的相關(guān)性

3 討論

Hp常定位于胃黏膜，是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，Hp-L是其中的一個(gè)變異類型，主要生成于不利于Hp生長(zhǎng)的條件之中，即便是在消除相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素后，Hp-L型仍可能持續(xù)存在并產(chǎn)生毒性作用，和原菌Hp相比，更具有侵襲性、黏附性和威脅性，且其會(huì)持續(xù)性的對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞造成損傷，加速胃癌的進(jìn)展[8]。

ΜIF的分泌主要來自T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，關(guān)于其在惡性腫瘤中的作用近年來也備受學(xué)者重視；目前的研究發(fā)現(xiàn)，ΜIF在諸多腫瘤中均具有更高表達(dá)，且可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分裂、血管生成等，導(dǎo)致病情進(jìn)展[9]。另也有報(bào)道指出，在胃炎、腸上皮化生的胃黏膜、胃癌組織中均能檢測(cè)出ΜIF的表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)呈逐漸遞增表現(xiàn)[10]。ΜΜP-9是ΜΜPs家族的重要成員，在體內(nèi)被激活后可生成Ⅳ型膠原酶，并對(duì)腫瘤表面細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白造成破壞，加速腫瘤向周圍組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，且其對(duì)血管基底膜具有降解作用，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而導(dǎo)致新生血管形成[11]。VEGF可在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生特異性的作用，主要可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，是機(jī)體血管形成的重要標(biāo)志物，其表達(dá)的升高可加速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[12]。此外，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，由于腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)周圍正常細(xì)胞造成損傷，也會(huì)加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程[13]。IL-6、IL-1β均是機(jī)體重要的炎性介質(zhì)，在炎癥信號(hào)的刺激下，其表達(dá)和發(fā)生迅速性的升高，對(duì)其的評(píng)估有助于判斷機(jī)體炎癥狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中Hp-L感染陽(yáng)性率為69.19%，明顯比癌旁組織要高，和陳聰英等[14]結(jié)果具有相似性。而在胃癌Hp-L感染陽(yáng)性患者中ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的陽(yáng)性率及血清IL-6、IL-1β的表達(dá)更高，隨著Hp-L感染程度的加重，這種表達(dá)情況更加明顯。在本研究的相關(guān)性分析中顯示，Hp-L感染陽(yáng)性和ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相關(guān)，通過分析是由于，①Hp-L感染可生成細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)等具有毒性的因子，直接在胃黏膜產(chǎn)生作用，加重胃黏膜上皮的損傷程度，促使細(xì)胞基因發(fā)生突變；YULIZAL等[15]研究顯示，CagA可刺激ΜIF的分泌增加；加上在惡性腫瘤患者中，隨著體內(nèi)T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的增加，也同樣會(huì)加劇ΜIF的釋放，而隨著ΜIF的增加，又會(huì)激活機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，此過程可形成一種惡性循環(huán)，逐漸導(dǎo)致感染程度加重。②胃癌患者發(fā)生Hp-L感染后機(jī)體會(huì)出現(xiàn)慢性炎癥表現(xiàn)，增加血清IL-6、IL-1β的表達(dá)，并持續(xù)性的損傷胃黏膜造成損傷，隨著感染程度的加重，可導(dǎo)致組織發(fā)生水腫，壓迫到毛細(xì)血管，造成局部組織缺氧，此過程會(huì)導(dǎo)致VEGF表達(dá)的明顯增加，加速內(nèi)皮細(xì)胞生成，繼而又增加ΜΜP-9的大量分泌，各因素之間相互協(xié)同、相互促進(jìn)。但本研究也有不足，例如未觀察上述指標(biāo)和胃癌患者臨床病理之間的關(guān)系等，此后也將持續(xù)深入探討。

綜上所述，ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β水平與胃癌Hp-L感染陽(yáng)性均呈正相關(guān)，且隨著感染程度的加重表達(dá)越高。