劉倩倩，蔣 磊

（安徽省第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230041）

復(fù)方羅布麻片Ⅰ是由羅布麻葉、野菊花、防己3味中藥及泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6、維生素B1、硫酸雙肼屈嗪、鹽酸異丙嗪組方的復(fù)方制劑，是臨床常用降血壓藥，藥效協(xié)同［1－3］，成分復(fù)雜［4－5］。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有氫氯噻嗪［6－7］的含量測(cè)定和鹽酸異丙嗪的薄層鑒別，過(guò)于簡(jiǎn)單，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。本研究中參考文獻(xiàn)［8－11］，分析了極性及穩(wěn)定性等性質(zhì)來(lái)確定溶劑、固定相及流動(dòng)相，最終采用高效液相色譜雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定該復(fù)方制劑中泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AD型高效液相色譜儀，配有LC－20AD型紫外可見(jiàn)光度檢測(cè)器（日本島津公司）；Elmasonic P 60H型超聲儀（德國(guó)Elmasonic公司，功率為320 W，頻率為80 kHz）；XS－105型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；BINDER PD60型電熱干燥箱（德國(guó)Binder公司）。

1.2 試藥

泛酸鈣對(duì)照品（批號(hào)為100370－201402，純度為97.5%），氫氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)為100309－201103，純度為99.8%），維生素B6對(duì)照品（批號(hào)為100116－201103，純度為99.9%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方羅布麻片Ⅰ（某藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)分別為151001，151002，151003）；庚烷磺酸鈉、乙腈、甲醇均為色譜純，水和冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.12%庚烷磺酸鈉（A，冰醋酸調(diào)pH至3.0）－乙腈（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：泛酸鈣200 nm，其他275 nm；進(jìn)樣量：20μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制備

對(duì)照品貯備液：取泛酸鈣對(duì)照品12.5 mg，氫氯噻嗪對(duì)照品16.0 mg，維生素B6對(duì)照品12.5 mg，精密稱定，分別置50 mL，10 mL，25 mL容量瓶中，泛酸鈣和維生素B6加流動(dòng)相溶解稀釋，氫氯噻嗪先加2 mL甲醇超聲溶解，再加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備液A，B，C。

對(duì)照品溶液：精密量取上述對(duì)照品貯備液A，B，C各1 mL，分別置10，100，10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液A，B，C。

供試品溶液：取本品20片，研細(xì)，取粉末適量（約相當(dāng)于氫氯噻嗪3.2 mg）精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，加流動(dòng)相適量，超聲處理30 min，使其溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，過(guò)濾，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例制備不含泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察及檢測(cè)限與定量限測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品貯備液A，B，C各1，3，5，10，15，20 mL，分別置50 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。分別以信噪比（S／N）為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)測(cè)得各化合物的檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各被測(cè)成分線性關(guān)系考察、檢測(cè)限及定量限測(cè)定結(jié)果（n＝6）Tab.2 Linear ranges of three components and the results of LOQ and LOD（n＝6）

精密度試驗(yàn)：分別精密量取上述對(duì)照品溶液A，B，C各20μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為0.34%，0.12%，0.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6峰面積的RSD分別為1.18%，0.35%，0.31%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為151001）樣品6份，依法制備供試品溶液，以外標(biāo)法計(jì)算泛酸鈣、氫氯噻嗪及維生素B6的含量。結(jié)果含量的RSD分別為0.31%，0.29%，0.53%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為151001）樣品1片，研細(xì)取粉末，置50 mL容量瓶中，依法制備供試品溶液，分別加入對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣20μL，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為151001，151002，151003），依法制備供試品溶液，分別精密量取20μL，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果3批樣品中泛酸鈣、氫氯噻嗪、維生素B6的平均含量分別為43.26%，95.54%，52.38%。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

曾比較Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Agilent 5HC C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Waters Symmetry Shield C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的色譜圖，以分離度為優(yōu)化指標(biāo)，結(jié)果4種色譜柱的分離度分別為3.125，1.875，3.075，1.950，故色譜柱選擇Kromasil C18柱。

3.2 溶劑選擇

參考文獻(xiàn)［12－13］，氫氯噻嗪在水中不溶，在乙醇中微溶。流動(dòng)相中有機(jī)相比例小，故先采用適量甲醇超聲溶解，加流動(dòng)相定容。泛酸鈣極不穩(wěn)定，易降解，水溶液中顯中性或弱堿性，流動(dòng)相為酸性環(huán)境，故泛酸鈣極易降解，需要及時(shí)配制。樣品中含有多種中藥，成分復(fù)雜，且流動(dòng)相中離子對(duì)濃度大，故應(yīng)對(duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù)。

3.3 波長(zhǎng)選擇

因泛酸鈣無(wú)最大吸收波長(zhǎng)，故于200 nm波長(zhǎng)處末端吸收測(cè)定含量，另2種物質(zhì)氫氯噻嗪和維生素B6的最大吸收波長(zhǎng)分別為271 nm和291 nm?？紤]到含量測(cè)定的均衡性，確定測(cè)定波長(zhǎng)為275 nm。因此，泛酸鈣測(cè)定波長(zhǎng)選擇200 nm，氫氯噻嗪和維生素B6測(cè)定波長(zhǎng)選擇275 nm。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的高效液相色譜雙波長(zhǎng)法，同時(shí)測(cè)定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中3組分的含量，簡(jiǎn)便易行，可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方羅布麻片Ⅰ中泛酸鈣、氫氯噻嗪和維生素B6的含量測(cè)定。