張 振，申京建，趙 明

（1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069； 2.北京世橋生物制藥有限公司，北京 101301）

《口服固體制劑：藥品GMP指南》［1］中對清潔驗證提出要求，以避免與設(shè)備表面接觸的活性藥物成分和其他藥品產(chǎn)生交叉污染，最大限度地保證患者的用藥安全。目前，多采用高效液相色譜（HPLC）法測定單組分藥品的含量，以進(jìn)行清潔驗證。但對于復(fù)方制劑，尤其是多組分復(fù)方制劑，如采用HPLC法，需保證所有組分能有效分離，且各組分均有足夠靈敏度才能保證殘留物質(zhì)的有效檢出和定量［2］。總有機(jī)碳（TOC）法［3］在清潔驗證中，特別是在復(fù)方制劑、中藥制劑［4］、生物制品［5］的應(yīng)用中越來越廣泛。相比HPLC法，TOC法靈敏度更高，分析時間短，且對輔料、清潔劑及未知物質(zhì)均具有檢出能力［6］。此外，TOC法屬非專屬性方法，只需測定TOC的含量，無需進(jìn)行各組分的分離，方法更簡易。復(fù)方氨基酸（19）丙谷二肽注射液中共有20種氨基酸物質(zhì)［7］，均可溶于水，由于注射液中N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺的濃度占比最大，故本研究中以N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺為指標(biāo)物，建立了該注射液生產(chǎn)后清潔驗證樣品的TOC分析法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器

TOC900型總有機(jī)碳分析儀（美國GE公司）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01mg）；KH－500DE型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140702－201102，純度為99.8%）；聚酯纖維棉簽（深圳市華晨陽科技有限公司，批號為CY715A）。

1.3 材料

10 cm×10 cm的不銹鋼板。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液及樣品制備

稀釋劑檢查：量取40 mL稀釋劑（水，TOC的質(zhì)量濃度小于0.1μg／mL），加入一個TOC小瓶中，并測定TOC。

空白棉簽預(yù)處理：取20支棉簽，置1 000 mL燒杯中，量取稀釋劑400 mL浸沒棉簽，密封，超聲10 min，靜置30 min，振搖洗滌1 min，甩去遺留水分，加入稀釋劑400 mL，浸沒棉簽，再振搖洗滌1 min，甩去遺留水分，重復(fù)上述操作5次，即得處理過的棉簽（棉簽TOC的質(zhì)量濃度應(yīng)小于0.25μg／mL）。

空白棉簽樣品制備：取1根處理過的棉簽，切除末端，放入TOC小瓶中，加入40mL稀釋劑，放置1h，取出，測定。

樣品制備：取1根處理過的棉簽，加稀釋劑浸濕，用1根取樣棉簽按擦拭取樣規(guī)程擦拭100 cm2的取樣部位，擦拭路線及方法見圖1。按圖1 A的路線，用棉簽的一側(cè)擦拭，擦拭時盡量覆蓋全部面積，用力均勻；使用同1根棉簽的另一面，按圖1B的路線擦拭；依次按圖1 C和圖1 D的路線，用同1根棉簽的不同側(cè)面擦拭。擦拭完畢后將棉簽?zāi)┒饲谐?，放入裝有40 mL稀釋劑的TOC小瓶中，靜置1 h，取出棉簽，將該溶液稀釋10倍后進(jìn)行測定。

圖1 棉簽擦拭路線及方法Fig.1 Swab wiping route and method

2.2 方法學(xué)考察［8－9］

檢測限和定量限考察：將處理過的棉簽（切除末端）放入TOC小瓶中，用40 mL稀釋劑浸泡，靜置1 h，制備10份，取出，測定，記錄TOC響應(yīng)值。結(jié)果響應(yīng)值的平均值為0.05823μg／mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.60；當(dāng)相對自由度為n－1、自由度為9、置信度為99%時，t為3.25（n＝10）。按公式分別計算檢測限和定量限。檢測限＝t×標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限＝3×檢測限。結(jié)果檢測限和定量限分別為0.018 19μg／mL和0.054 47μg／mL。

線性關(guān)系考察：取N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品適量，精密稱定，配制質(zhì)量濃度分別為0.199，0.498，0.996，1.494，1.992，2.988μg／mL的系列對照品溶液，進(jìn)樣測定，并記錄TOC響應(yīng)值，以對照品質(zhì)量濃度（X，mg／mL）為橫坐標(biāo)、TOC響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝362.862 5X＋277.736 3，r＝0.996 8（n＝6）。結(jié)果表明，N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺的質(zhì)量濃度在0.199～2.988μg／mL范圍內(nèi)與TOC響應(yīng)值線性關(guān)系良好。

擦拭回收試驗［10－11］：取N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品9.96 mg，精密稱定，用稀釋劑稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg／mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)添加液。取3塊10 cm×10 cm的潔凈不銹鋼板，用微量注射器分別均勻滴加標(biāo)準(zhǔn)添加液400，600，800μL，自然風(fēng)干，平行制備3份，取1根預(yù)處理過的棉簽，按2.1項下方法制備樣品，并提取擦拭回收樣品，進(jìn)樣測定，根據(jù)回歸方程計算測得量，依法計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 擦拭回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab.1 Results of the wipe recovery test（n＝9）

精密度試驗：按擦拭回收試驗平行制備6份添加600μL標(biāo)準(zhǔn)添加液的樣品，進(jìn)樣測定。結(jié)果TOC響應(yīng)值的RSD為2.92%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取稀釋劑、空白棉簽溶液及樣品溶液，分別于0和12 h時進(jìn)樣測定，并依次記錄TOC響應(yīng)值，考察各溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（×10－3μg／mL）Tab.2 Results of the stability test（×10－3μg／mL）

2.3 清潔驗證樣品測定結(jié)果

為了確認(rèn)樣品直接接觸的設(shè)備、系統(tǒng)或設(shè)施清潔后能保證化學(xué)成分和上一批產(chǎn)品可能的殘留物在可接受范圍內(nèi)［12］，采用風(fēng)險評估法選取取樣位置［13］，并按2.1項下取樣方式取樣，測定TOC響應(yīng)值。按照生產(chǎn)流程，涉及設(shè)備清潔驗證樣品結(jié)果見表3。

表3 清潔驗證樣品檢測結(jié)果Tab.3 Results of cleaning validation of the samples

3 討論

3.1 允許殘留限度［14］確定

按10μg／mL標(biāo)準(zhǔn)計算，允許殘留限度為12.04μg／cm2，TOC分析結(jié)果使用TOC評判，故需將殘留限度轉(zhuǎn)換為TOC限值，20種氨基酸中?；撬岬暮剂孔畹蜑?9.2%，則TOC限值＝12.04μg／cm2×19.2%＝2.31μg／cm2。根據(jù)樣品制備過程進(jìn)行折算，則允許殘留限度為2.31μg／cm2×100 cm2÷40 mL÷10＝0.578μg／mL。

3.2 氧化劑流速［15］確定

在TOC試驗中，TOC分析儀通過使用紫外線輻射和化學(xué)氧化劑（過硫酸銨），使有機(jī)化合物因氧化反應(yīng)而產(chǎn)生二氧化碳，再分別測定無機(jī)碳和總碳以確定TOC。而氧化劑的流速決定了反應(yīng)中氧化劑用量，流速過低導(dǎo)致分析物不完全氧化；流速過高，可能導(dǎo)致測得的TOC值較低。為了確定最優(yōu)氧化劑流速，分別考察了氧化劑流速為0，0.1，0.2，0.3，0.4μL／min時的TOC響應(yīng)值，結(jié)果各條件下所得TOC值基本一致。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，故將氧化劑流速設(shè)置為0.1μL／min。

3.3 實驗室條件要求

清潔驗證允許的殘留限度很低，同時TOC又具有高靈敏度，一般實驗室條件下有許多有機(jī)試劑（如甲醇、乙腈等）易揮發(fā)小分子，若試劑揮發(fā)到空氣中，并溶解到TOC樣品中，可能導(dǎo)致假陽性。故TOC試驗應(yīng)避免在含有易揮發(fā)有機(jī)試劑的同一實驗室內(nèi)進(jìn)行。

綜上所述，該方法分析時間短、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于復(fù)方氨基酸（19）丙谷二肽注射液生產(chǎn)后的清潔驗證。