劉婷婷，楊玲霞，羅 宇，陳 鳴

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 710065； 2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070）

六味大托葉云實(shí)散由大托葉云實(shí)、紅花、石榴子、肉桂等6味中藥組方，是藏醫(yī)治療婦科疾病的常用方劑，療效確切［1］。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊(cè)）》［2］，但無(wú)定性和定量指標(biāo)，僅收載了常規(guī)檢查項(xiàng)，已不能很好適應(yīng)現(xiàn)代化控制藥品質(zhì)量的要求。為全面控制該制劑的質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜法對(duì)方中石榴子、紅花進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定紅花中指標(biāo)成分羥基紅花黃色素A的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ－700TDE型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為700 W，頻率為80 kHz）；XS205DU型分析天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；5810R型低溫離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）。

1.2 試藥

六味大托葉云實(shí)散（天祝藏族自治縣藏醫(yī)藥開(kāi)發(fā)研究所，批號(hào)分別為20030302，20042602，20050901）；石榴子對(duì)照藥材（批號(hào)為121431－201002），紅花對(duì)照藥材（批號(hào)為120907－201713），羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)為111637－201810，含量以93.1%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

石榴子：取樣品3 g，加乙醇并超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至干，加乙醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取石榴子對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例及工藝，制備不含石榴子的陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷－甲醇（6∶4，V／V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 A（溫度為20℃，相對(duì)濕度為36%，展距為10 cm）。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

紅花：取本品2g，加80%丙酮6mL，超聲處理20min，離心，取上清液作為供試品溶液。取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例及工藝制備不含紅花的陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－水－甲醇（7∶3∶2∶0.4，V／V／V／V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1B（溫度為20℃，相對(duì)濕度為38%，展距為10cm）。

2.2 羥基紅花黃色素A含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－乙腈－0.7%磷酸溶液（26∶2∶72，V／V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取樣品0.3 g，精密稱定，精密加入25%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（功率為700 W，頻率為80 kHz），放冷，用25%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含紅花的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。詳見(jiàn)圖2。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處具有相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照品溶液在該保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明方法專屬性良好。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為17.92μg／mL）1，3，5，7，10，12μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝2.1761×103X－1.5432×103，r＝0.9992（n＝6）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A進(jìn)樣量在17.92～215.04μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A峰面積的RSD為0.88%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液10μL（批號(hào)為20030302），按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為0.69%（n＝6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20030302）樣品，依法制備供試品溶液，共6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A含量的RSD為0.77%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20030302）樣品6份，每份0.15 g，精密稱定，分別加入質(zhì)量濃度為0.4016mg／mL的羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液2.0mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test of hydroxyl safflower yellow pigment A（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品3批（批號(hào)分別為20030302，20042602，20050901），各2份，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定。結(jié)果3批樣品中羥基紅花黃色素A的含量分別為4.62，4.12，4.03 mg／g。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別條件選擇

參考文獻(xiàn)［3］試驗(yàn)條件，石榴子對(duì)照藥材溶液薄層色譜斑點(diǎn)分離度不好，且陰性對(duì)照有干擾。改展開(kāi)劑為二氯甲烷－甲醇（6∶4，V／V），展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下烘至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.2 HPLC法含量測(cè)定條件選擇

指標(biāo)成分選擇：紅花具有散瘀止痛、活血通經(jīng)功效，用于痛經(jīng)、經(jīng)閉、瘕痞塊、惡露不行等證，為婦科要藥［4－8］。羥基紅花黃色素A為紅花中主要指標(biāo)成分，能有效反映紅花的質(zhì)量，其產(chǎn)地、采摘時(shí)間、貯存時(shí)間等對(duì)質(zhì)量影響較大。文獻(xiàn)［9－11］報(bào)道，紅花中羥基紅花黃色素A的含量最低為1.03%，最高為4.73%。因此，對(duì)制劑中的紅花進(jìn)行質(zhì)量控制很有必要。故選擇高效液相色譜法測(cè)定方中紅花指標(biāo)成分羥基紅花黃色素A的含量。

色譜條件選擇：目前，關(guān)于紅花中羥基紅花黃色素A的檢測(cè)方法均較成熟［9－15］。采用2015年版《中國(guó)藥典（一部）》紅花中羥基紅花黃色素A的色譜條件［15］，測(cè)定六味大托葉云實(shí)散中羥基紅花黃色素A的含量，陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)。

提取溶劑選擇：羥基紅花黃色素A為親水性成分，在水和低濃度醇中的溶解度均較大。本試驗(yàn)中先后采用純水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇作為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果當(dāng)采用25%甲醇超聲處理30 min時(shí)，羥基紅花黃色素A的溶解度大，且過(guò)濾較容易，故選擇25%甲醇為提取溶劑。