鄭依玲，梅全喜，歐陽(yáng)勇，胡 瑩，宋 葉

（1.廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800； 2.廣東省深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518101；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528401）

痛瀉要方又名白術(shù)芍藥散，由炒白術(shù)、炒白芍、炒陳皮、防風(fēng)4味中藥組方，臨床主要用于治療腹瀉型腸易激綜合征、慢性腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎等［1］。研究發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方對(duì)家兔、大鼠等試驗(yàn)動(dòng)物的離體腸平滑肌具有一定抑制作用［2－3］，但具體作用機(jī)制尚不明確，且藥理研究多為中藥傳統(tǒng)飲片，破壁飲片的研究極少。本研究中探討了痛瀉要方破壁飲片及其傳統(tǒng)飲片對(duì)大鼠小腸離體平滑肌收縮振幅、頻率及張力的影響，為臨床應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

ISO 510－A型放大器，TRT201A型壓力傳感器，LE 13206 Thermostat型水浴槽和加熱器，均購(gòu)自美國(guó)哈佛儀器公司；PowerLab8／30型生物機(jī)能記錄系統(tǒng)，CCA－1112A型冷卻水循環(huán)裝置，均購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司；JA1203N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為千分之一）；TLE204型電子天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為千分之一）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

痛瀉要方破壁飲片（中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20170125）；白術(shù)（批號(hào)為20161028），芍藥（批號(hào)為20160927），陳皮（批號(hào)為20160530），防風(fēng)（批號(hào)為20160803），均為中藥飲片，購(gòu)自中智大藥房，保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院藥檢室；乙二醇雙（2－氨基 乙基醚）四乙 酸（EGTA，Scientific Research Special公司，批號(hào)為20170502）；維拉帕米（源葉生物公司，批號(hào)為Y05J6C2）；氯化鈉（NaCl，批號(hào)為1708311），氯化鉀（KCl，批號(hào)為1609251），均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO3，西隴化工股份有限公司，批號(hào)為1001041）；無(wú)水硫酸鎂（MgSO4，批號(hào)為20171008），碳酸氫鈉（NaHCO3，批號(hào)為20181109），均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水氯化鈣（CaCl2，廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)為0705292）；葡萄糖（C6H12O6·H2O，天津歐博凱化工有限公司，批號(hào)為1907247）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠10只，雄性，體質(zhì)量200～300 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018－0002，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2012－0125，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)12 h晝夜交替，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～67%，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 藥液制備

取NaCl（濃度為118 mmol／L）6.896 g，KCl（濃度為4.75 mmol／L）0.354 g，MgSO4（濃度 為1.18 mmol／L）0.142 g，精密稱(chēng)定，溶于200 mL蒸餾水，為A試劑；取NaHCO3（濃度為24.8 mmol／L）2.083 g，KH2PO3（濃度為1.18 mmol／L）0.161 g，精密稱(chēng)定，溶于200 mL蒸餾水，為B試劑。取A試劑和B試劑，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz），溶解，將B試劑加入A試劑中，補(bǔ)充蒸餾水至600mL，為AB混合液；取CaCl2（濃度為2.5mmol／L）0.277g，精密稱(chēng)定，溶于200mL蒸餾水，超聲溶解，為C試劑；于超聲狀態(tài)下，在AB混合液中緩慢加入C試劑，用蒸餾水定容至1 000 mL，為ABC混合液；取C6H12O6·H2O（濃度為10 mmol／L）1.982 g，精密稱(chēng)定，于試驗(yàn)前加入ABC混合液中，溶解，混勻，于4℃保存待用，即得克氏液。

稱(chēng)取白術(shù)90 g，白芍60 g，陳皮45 g，防風(fēng)30 g，加10倍量的蒸餾水浸泡30 min，回流提取30 min，8層紗布濾過(guò)；藥渣再加10倍量蒸餾水，回流提取30 min，8層紗布濾過(guò)，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量為2.813 g／mL，置4℃冰箱保存，待用；試驗(yàn)時(shí)用無(wú)Ca2＋的克氏液配制成質(zhì)量濃度為0.5 g／mL的痛瀉要方傳統(tǒng)飲片溶液。

稱(chēng)取破壁飲片適量，用無(wú)Ca2＋的克氏液溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.5 g／mL的痛瀉要方破壁飲片溶液。

2.1.2 離體小腸平滑肌標(biāo)本制備

試驗(yàn)前，恒溫箱溫度恒定在37℃，清洗浴槽2～3次，加入克氏液，37℃預(yù)熱。SPF級(jí)SD大鼠禁食不禁飲24 h，立即脫臼處死，迅速打開(kāi)腹腔，找到小腸部位，分離，剪下，將腸內(nèi)容物用克氏液輕柔沖洗干凈，分別將小腸剪成1 cm長(zhǎng)，共8段，立刻浸入盛有4℃克氏液的培養(yǎng)皿中，剪去系膜后制成1 cm長(zhǎng)的小腸標(biāo)本，持續(xù)通入95%O2與5%CO2的混合氣體，打開(kāi)儀器，調(diào)好參數(shù)，選擇1 g砝碼后將基線調(diào)零，定標(biāo)，將小腸肌條置含有5 mL克氏液、溫度為（37±0.5）℃的離體器官浴槽內(nèi)，一端連于通氣鉤，另一端連于張力換能器，并持續(xù)通入95%O2加5%CO2的混合氣體，使通氣量穩(wěn)定（氣泡成一條直線）；初始負(fù)荷為0.2 g，待肌條適應(yīng)20 min后，每2 min上調(diào)0.2 g，直至1 g，待肌條產(chǎn)生規(guī)律恒定的波形后，平衡60 min，先記錄一段正常曲線，再開(kāi)始試驗(yàn)［4］。

2.1.3 分組與給藥

每次試驗(yàn)時(shí)剪取同一只大鼠的小腸，共制備8個(gè)平滑肌標(biāo)本，分為痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組和痛瀉要方破壁飲片組。在有Ca2＋的克氏液中平衡1 h，加入濃度為60.00mmol／L的高鉀溶液100μL，激動(dòng)1 cm腸管5 min，換成無(wú)Ca2＋的克氏液沖洗3次，平衡60 min，后加入L型鈣通道阻滯劑維拉帕米（濃度為1.00μmol／L）10μL和EGTA（濃度為10－4mol／L）100μL，立即按累積加藥法用無(wú)Ca2＋的克氏液配制成質(zhì)量濃度為0.30，1.00，3.00，6.00，12.00，24.00，36.00，48.00，60.00μg／mL的系列痛瀉要方傳統(tǒng)飲片溶液及其破壁飲片溶液，每隔5 min增加1個(gè)質(zhì)量濃度，取加藥前（即質(zhì)量濃度為0μg／mL）的收縮情況為空白對(duì)照，10 min后向浴槽內(nèi)加入濃度為2.50 mmol／L的Ca2＋，引起肌條收縮；空白對(duì)照組則用同體積無(wú)Ca2＋的克氏液代替痛瀉要方傳統(tǒng)飲片溶液及其破壁飲片溶液，其余步驟與給藥組相同。統(tǒng)計(jì)并分析小腸平滑肌收縮張力、頻率、振幅變化曲線［5］，按以下公式計(jì)算。

張力抑制率（%）＝［（加藥前平均張力－加藥后平均張力）／加藥前平均張力］×100%

振幅抑制率（%）＝［（加藥前平均振幅－加藥后平均振幅）／加藥前平均振幅］×100%

頻率抑制率（%）＝［（加藥前平均頻率－加藥后平均頻率）／加藥前平均頻率］×100%

2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，GraphPad Prism 5.0軟件畫(huà)圖。計(jì)量資料采用表示，行單因素方差（One－Way ANOVA）分析，方差齊時(shí)組間比較采用Dunnett法，方差不齊時(shí)組間比較采用Dunnett′s－T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 3組大鼠小腸平滑肌收縮頻率抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.2 Comparison of inhibition rate of the contraction frequency of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表2 3組大鼠小腸平滑肌收縮頻率抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.2 Comparison of inhibition rate of the contraction frequency of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

給藥質(zhì)量濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對(duì)照組0.61±0.33 1.13±0.49 1.68±0.56 2.15±0.55 2.96±0.65 3.38±0.82 3.88±0.91 4.91±0.79 5.46±0.86痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組1.42±0.71*3.10±0.97**6.25±2.13**9.58±2.15**14.44±3.42**18.36±3.75**21.95±4.25**26.12±5.21**28.77±3.41**痛瀉要方破壁飲片組3.51±1.33**＃＃6.96±1.17**＃＃11.90±3.40**＃＃17.25±3.35**＃＃22.98±4.97**＃＃27.80±5.74**＃＃32.10±6.14**＃＃40.56±6.20**＃＃44.75±4.02**＃

2.2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1至表3?？梢?jiàn)，與空白對(duì)照組比較，痛瀉要方破壁飲片組與痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮的張力、頻率、振幅的抑制作用均顯著增強(qiáng)，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05或P＜0.01）。與痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組比較，當(dāng)給藥質(zhì)量濃度不低于36.00μg／mL時(shí)，痛瀉要方破壁飲片組對(duì)大鼠離體小腸平滑肌收縮張力的抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）；當(dāng)給藥質(zhì)量濃度不低于0.30μg／mL時(shí)，痛瀉要方破壁飲片組對(duì)大鼠離體小腸平滑肌收縮頻率、振幅的抑制作用均顯著增強(qiáng)，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05或P＜0.01）。當(dāng)給藥質(zhì)量濃度達(dá)到60μg／mL時(shí)，痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮張力抑制率為（23.50±6.96）%，收縮頻率抑制率為（28.77±3.41）%，收縮振幅抑制率為（24.04±0.70）%；痛瀉要方破壁飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮張力抑制率為（27.09±8.56）%，收縮頻率抑制率為（44.75±4.02）%，收縮振幅抑制率為（38.23±1.94）%。

表1 3組大鼠小腸平滑肌收縮張力抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.1 Comparison of inhibition rate of the contraction tension of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表1 3組大鼠小腸平滑肌收縮張力抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.1 Comparison of inhibition rate of the contraction tension of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。表2和表3同。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜ 0.01；compared with those in the traditional decoction pieces group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；as well as Tab.2 and Tab.3.

給藥質(zhì)量濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對(duì)照組0.57±0.97 1.01±1.26 1.16±1.16 1.35±1.11 1.58±1.24 1.77±1.22 1.87±1.24 2.41±1.13 2.55±1.11痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組1.79±1.13*9.14±5.16**11.32±3.48**11.88±3.55**15.27±3.96**16.10±3.62**17.21±5.59**18.15±7.03**23.50±6.96**痛瀉要方破壁飲片組2.12±0.93*7.72±2.57**11.55±2.70**14.72±3.68**17.86±5.35**20.87±5.87**24.36±6.51**＃26.74±7.81**＃27.90±8.56**＃

表3 3組大鼠小腸平滑肌收縮振幅抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.3 Comparison of inhibition rate of the contraction amplitude of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表3 3組大鼠小腸平滑肌收縮振幅抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.3 Comparison of inhibition rate of the contraction amplitude of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

給藥濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對(duì)照組0.45±0.38 0.97±0.61 1.69±0.76 2.32±0.94 2.68±0.55 3.38±0.56 4.08±0.73 4.89±0.95 5.57±1.01痛瀉要方傳統(tǒng)飲片組1.86±0.54**4.00±0.57**6.45±1.20**8.09±0.99**10.90±0.79**13.57±1.01**15.97±1.36**20.70±0.74**24.04±0.70**痛瀉要方破壁飲片組4.63±0.62**＃＃7.98±0.75**＃＃10.36±0.76**＃＃14.20±0.58**＃＃15.70±0.59**＃＃18.37±0.86**＃＃22.61±0.75**＃＃31.47±1.08**＃＃38.23±1.94**＃＃

3 討論

痛瀉要方為治療肝郁脾虛型“泄瀉”的經(jīng)典方劑，為了突出其主治特點(diǎn)痛瀉而命名為痛瀉要方［1］?！兜は姆ā分邪仔g(shù)芍藥散為此方最早的記載，“痛瀉”之方名首見(jiàn)于《醫(yī)方考》，其痛瀉之證為脾虛肝郁、木乘土虛、脾失健運(yùn)所致，治宜止瀉祛濕，抑肝補(bǔ)脾為大法。痛瀉要方中，君藥白術(shù)可燥濕補(bǔ)脾，益氣健脾，以治土虛；臣藥白芍平肝柔肝，緩急止痛，與白術(shù)相伍，瀉木補(bǔ)土，止痛止瀉，調(diào)和肝脾；佐藥陳皮行氣、止痛，健脾、燥濕，對(duì)脾胃運(yùn)化的強(qiáng)化之功最佳；使藥防風(fēng)為引藥專(zhuān)入肝脾，加強(qiáng)祛風(fēng)勝濕、止痛之效。全方配伍合理，共奏補(bǔ)脾祛濕止瀉、柔肝止痛功效。相較于傳統(tǒng)飲片，破壁飲片經(jīng)過(guò)超微粉碎技術(shù)的破壁處理后，藥材有效成分的溶出率大幅提高，不僅使藥材利用率大大增加，還有效提高了藥材中有效成分的均勻性，且藥品安全性和穩(wěn)定性較傳統(tǒng)飲片均更易控制；同時(shí)，易攜帶，可直接沖水泡服，便于臨床醫(yī)師遣方用藥，滿(mǎn)足多方需求［6］。

腸道平滑肌電荷運(yùn)動(dòng)的相關(guān)活動(dòng)，主要與Ca2＋，Cl－，Na＋，K＋等離子有關(guān)。其中，Ca2＋參與腸道平滑肌的激發(fā)－收縮耦聯(lián)，直接或間接控制平滑肌的收縮性，是生物細(xì)胞重要信息的傳遞使者，可調(diào)節(jié)平滑肌的收縮狀態(tài)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種重要功能［7－8］。［Ca2＋］i的增加是收縮的主要刺激來(lái)源［9－10］。細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流在結(jié)腸平滑肌收縮中起主要作用，其通道包括通過(guò)受體操控性鈣通道（ROCC）、電壓門(mén)控鈣離子通道（VGC）、鈣庫(kù)調(diào)控性鈣離子通道（SOC）［11］。而胃腸道平滑肌主要通過(guò)VGC促使細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流，特別是通過(guò)L型的VGC進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［12－13］。

本試驗(yàn)中，通過(guò)加入濃度為60 mmol／L的KCl溶液誘導(dǎo)質(zhì)膜去極化，從而使VGC通道開(kāi)放，激活L型Ca2＋通道，細(xì)胞外Ca2＋通過(guò)L型Ca2＋通道內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞。維拉帕米是典型的L型鈣通道阻滯劑，當(dāng)換成無(wú)鈣克氏液時(shí)，Ca2＋外流，加入維拉帕米阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)通過(guò)L型Ca2＋通道對(duì)細(xì)胞外Ca2＋的再攝取，使細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的Ca2＋從細(xì)胞內(nèi)順濃度梯度釋放到細(xì)胞外。EGTA是鈣離子螯合劑，能與細(xì)胞外Ca2＋螯合。因此，維拉帕米和EGTA合用，可逐漸耗竭細(xì)胞外Ca2＋，并阻斷Ca2＋通過(guò)VGC進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，加入痛瀉要方破壁飲片或其傳統(tǒng)飲片后，大鼠離體小腸平滑肌肌條的收縮隨濃度的增大而減小，表明2種飲片可協(xié)同維拉帕米阻斷VGC通道，抑制細(xì)胞外Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋外流，使鈣庫(kù)逐漸耗竭，減少肌條收縮活動(dòng)，減弱小腸平滑肌收縮的張力、頻率、振幅，并呈濃度依賴(lài)性，且痛瀉要方破壁飲片的效果要優(yōu)于其傳統(tǒng)飲片。