蘭進茂，覃瑞，夏婧

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 & 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

菊科華蟹甲屬(Sinacalia)是中國特有屬，與蟹甲草屬(Parasenecio)的顯著區(qū)別是頭狀花序具有舌狀花以及具有肥大的塊莖. 該屬于1973年從蟹甲草屬分出成立，僅包括4個種：華蟹甲、雙花華蟹甲、革葉華蟹甲和大頭華蟹甲[1-3]. 不過最近的分子系統(tǒng)發(fā)育分析揭示出華蟹甲屬和蟹甲草屬都是多系的，但華蟹甲(S.tangutica)和雙花華蟹甲(S.davidii)兩個物種在一起可以保留華蟹甲草屬[4-5]. 其中華蟹甲是分布相對較廣的高大草本植物，常見于我國中西部地區(qū)的1250～3500 m的山坡草地、懸崖、溝邊、草甸或林緣和路邊. 近年的研究表明華蟹甲是一種在抗氧化和抗II型糖尿病等方面具有潛在應(yīng)用價值的重要植物[6-9]. 目前從生物學(xué)角度對華蟹甲的研究工作非常少，除了劉建全等對華蟹甲的染色體核型進行了研究以及近年來構(gòu)建菊科千里光族的譜系發(fā)育樹包括了華蟹甲之外[4-5,10]，從遺傳多樣性角度以分子生物學(xué)角度分析的研究工作幾乎是空白.

SSR(Simple Sequence Repeats)是第二代分子標記，具有共顯性、多態(tài)性高等特點，其數(shù)量豐富，分布廣可以覆蓋整個基因組. 鑒于華蟹甲屬目前沒有公布的基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究采用簡化基因組測序(Reduced Representation Genome Sequencing)的研究技術(shù)[11-13]，對華蟹甲的SSR信息進行全面的分析，并據(jù)此開發(fā)其SSR分子標記，為華蟹甲的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ). 同時，華蟹甲作為一種具有潛在入侵性的大型草本植物[14]，開發(fā)其SSR的分析標記有助于為外來物種管理提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料和DNA提取

本研究所用華蟹甲采自湖北省七姊妹山國家級自然保護區(qū)(109.7737° E，30.0418° N). 沿著保護區(qū)到椿木營的小路，于2019年8月采集華蟹甲葉片材料，每株取植株上的幼嫩葉片，用變色硅膠裝入自封袋干燥. 共采集153株，用其中16株的材料進行SSR引物的篩選. 使用植物DNA提取試劑盒(TSINGKE通用性)進行基因組DNA提取，

1.2 簡化基因組文庫構(gòu)建與測序

將檢驗合格的DNA樣品交由北京擎科進行簡化基因組建庫與測序. 使用酶切法將DNA隨機打斷之后，再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增進行文庫構(gòu)建，然后進行高通量測序(DNBSEQ-T7測序儀，華大智造). 原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA 堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為以FASTQ 格式保存的測序序列(Sequenced Reads)，即原始序列數(shù)據(jù)(raw reads)，包含每條測序序列(Read)的名稱、堿基序列以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息. 每個堿基所對應(yīng)的質(zhì)量字符ASCII 碼值減去33得到測序質(zhì)量得分(Phred Quality Score)，代表不同的堿基測序錯誤率. 然后，原始序列數(shù)據(jù)用Cd-hit進行聚類并從中選取reads支持數(shù)為10～400的類，根據(jù)聚類結(jié)果用 Velvetopt(Velvet優(yōu)化程序)對基因組進行組裝，得到最后的組裝序列[15].

1.3 熒光SSR引物的設(shè)計、合成和篩選

1.3.1 引物設(shè)計、合成與篩選

利用MISA軟件(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)對二至六堿基核苷酸重復(fù)的SSR進行搜索，利用Primer 3軟件進行引物設(shè)計[16-18]. 從設(shè)計的引物中選出200對SSR引物進行合成作為引物初篩. 多態(tài)性引物的合成與篩選由北京擎科完成.

進行第一輪擴增時，在正向引物F的5′端加上通用16個堿基的Tag修飾序列. 從中篩選擴增條帶理想的PCR產(chǎn)物，然后用Tag修飾引物和對應(yīng)的反向R引物進行第二輪熒光引物PCR. 這樣，3條引物兩次擴增的方式可以達到多重擴增的目的. 對于篩選時有多態(tài)性，但是擴增效果不理想的引物，通過設(shè)計內(nèi)引物進行巢式擴增來提高PCR的敏感性和擴增的特異性. 第一輪擴增用外引物擴增，第二輪擴增用帶Tag 修飾接頭的內(nèi)引物進行擴增，第三輪篩選擴增條帶理想的PCR產(chǎn)物再用Tag修飾引物內(nèi)引物和對應(yīng)的反向R引物進行熒光引物PCR.

1.3.2 SSR-PCR擴增與檢測

用合成的200對SSR引物對16個華蟹甲樣品DNA進行擴增，以擎科2×TSINGKE Master Mix(blue)進行擴增. 第一輪擴增體系各組分如下： PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括2×TSINGKE Master Mix(blue) 10 μL，正向引物(加接頭，10 μM)1 μL，反向引物(10 μM) 1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL. PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、56～63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、35個循環(huán)，72 ℃延伸階段5 min，4 ℃保存. 第二輪擴增體系各組分如下： PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括2×TSINGKE Master Mix(blue) 10 μL，Tag修飾引物1 μL，反向引物(10 μM) 1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL. PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、54～62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、35個循環(huán)，72 ℃延伸階段5 min，4 ℃保存. 巢式引物第三輪擴增體系各組分如下：PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括2×TSINGKE Master Mix(blue) 10 μL，Tag修飾引物1 μL，反向引物(10 μM)1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL. PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、35個循環(huán)，72 ℃延伸階段5 min，4 ℃保存.

將擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)，300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖并確定模板濃度. 擴增良好的熒光PCR產(chǎn)物利用3730xl測序儀(美國ABI)毛細管電泳檢測.

1.3.3 位點分析與篩選

用軟件Gene mapper 4.1進行數(shù)據(jù)準確位點的分析，分析數(shù)據(jù)按照引物對應(yīng)關(guān)系的核心堿基重復(fù)數(shù)來確定位點準確大小. 例如(AG)6片段大小263, 應(yīng)加了Tag的16個堿基，所以大小實際為279. 根據(jù)分析出來的位點信息，選取特異性高，多態(tài)性好的位點做為后續(xù)研究的重點. 如圖1所示XJSSR119位點即為篩選出的一個多態(tài)性和特異性都很好的SSR引物.

圖1 XJSSR119位點在3個樣品中的基因型Fig.1 Genotypes of 3 samples at No. XJSSR119 SSR locus

2 結(jié)果與分析

2.1 簡化基因組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

華蟹甲DNA的RAD測序共產(chǎn)生Raw reads 1.910 G. 如果測序錯誤率用e表示， DNASEQ T7平臺測得數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量值用Qphred表示，則有：Qphred =-10log10(e). 華蟹甲簡化基因組原始數(shù)據(jù)中Phred數(shù)值大于20的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量的百分比(Q20)為96.7%；GC含量為36.8%. 質(zhì)量評估結(jié)果表明測序質(zhì)量合格，GC分布正常.

2.2 簡化基因組組裝

對華蟹甲簡化基因組進行組裝，總長度為357574425 bp，組裝總個數(shù)為2085798，組裝的平均長度為171 bp. 序列從大到小排列，當長度達到組裝總長度一半時，contig的長度為200 bp.

2.3 SSR檢測結(jié)果

對樣本組裝 contig 進行過濾，共得到雙端含有100 bp(用于之后設(shè)計引物)的精確型SSR 位點46674個，復(fù)合型SSR位點3062個. 其中，包含均有引物片段的SSR數(shù)目為43235，片段引物設(shè)計率為92%. 華蟹甲簡化基因組SSR位點類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在(表1). 各組分數(shù)量分析結(jié)果表明，華蟹甲的核基因組SSR主要以單、二和三堿基重復(fù)單元為主,單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量較多，占主導(dǎo)地位(圖2). 其中，單堿基重復(fù)基序數(shù)量最多(21529條，占總數(shù)46.13%)，其次為二核苷酸重復(fù)序列(18426條，占比39.48%)，再次為三核苷酸的重復(fù)序列(5861條，占12.55%)，其他類型的SSR序列很少(858條，只占1.84%). 重復(fù)單元數(shù)量分析結(jié)果表明：華蟹甲簡化基因組的精確型SSR位點總共含有321種重復(fù)單元；如圖2所示，重復(fù)單元最多的是單核苷酸重復(fù)(A/T)n,其次為二核苷酸重復(fù)(AC/GT)n和(AG/CT)n. 最常見的重復(fù)次數(shù)是重復(fù)10次，其次是6次(表2).

表1 華蟹甲簡化基因組SSR引物檢測結(jié)果Tab.1 The abundance of SSRs in S. tangutica

圖2 分布最豐富的SSR序列類型Fig.2 Numbers of the most abundance SSRs classified based on their motifs.

表2 華蟹甲簡化基因組不同類型SSR重復(fù)單元類型分布Tab.2 Frequencies of different SSR repeat motif types in S. tangutica

2.4 多態(tài)性SSR引物的開發(fā)與篩選

利用已合成的200對引物對16個華蟹甲樣品進行熒光SSR擴增，共篩選出特異性和多態(tài)性較高的引物共20對，其中5對引物另外設(shè)計了半巢氏引物(表3).

表3 華蟹甲SSR引物序列信息Tab.3 The information of SSR primer sequences of S. tangutica

3 討論

隨著新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于SSR標記的開發(fā). 目前開發(fā)SSR引物可以通過轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組測序和簡化基因組測序等多種方式進行. 但與前兩者相比，簡化基因組測序只對全基因組中限制性內(nèi)切酶酶切位點附近的片段進行高通量測序，從而降低了基因組的復(fù)雜性和測序量，因此獲得目標物種的序列遺傳信息經(jīng)濟快速. 此外，標記尋找采用不受參考基因組限制的tag 同源聚類的方法. 對于沒有足夠核算序列參考的物種而言，利用簡化基因組測序來開發(fā)SSR引物是一種比較理想可行的技術(shù)[11-13]. 本研究通過簡化基因組測序和組裝過濾，共得到雙端含有100 bp(用于之后設(shè)計引物)的精確型SSR 位點46674個，說明華蟹甲的SSR位點非常豐富. 雖然目前從200對合成引物中只篩選出了20對多態(tài)性高特異性強的引物，但是本研究將為后續(xù)基于SSR標記上的華蟹甲居群遺傳結(jié)構(gòu)和指紋圖譜等研究提供SSR標記數(shù)據(jù)庫.

菊科植物化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性均居植物界之首，幾乎包括了所有的天然化合物類型，是非常重要的天然藥庫.近年來對華蟹甲化學(xué)成分和藥理活性的研究都表明其有效成分具有抗腫瘤、消炎、抗菌和殺蟲等生物活性，可能會成為新型抗腫瘤、抗氧化、抗菌等特效藥物的重要來源[6-9,19-21]. 目前對華蟹甲的生物學(xué)研究非常少，尤其華蟹甲的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)還一無所知，而這些恰恰是今后物種可持續(xù)利用和保護的基礎(chǔ). 要開展遺傳多樣性的研究以及分子標記輔助育種(marker- assisted selection)等研究，分子標記的開發(fā)是第一步[11]. 雖然利用近緣種開發(fā)的SSR引物篩選目標物種所需標記也是一種相對快捷的手段，但是其通用性并不穩(wěn)定，存在較大的波動[22]. 此外，目前橐吾—垂頭菊—蟹甲草復(fù)合群(Ligularia-Cremanthodium-Paraseneciocomplex)中，已開發(fā)出來的SSR引物只有鹿蹄橐吾中的14對SSR以及大吳風(fēng)草中的8對引物[23-24]，在與之關(guān)系最近的蟹甲草屬中仍無相關(guān)報道. 因此，開發(fā)SSR 標記將為今后進行華蟹甲的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)，也可作為其近緣屬種的遺傳多樣性研究提供參考，具有重要的實際意義.

與此同時，菊科也是入侵植物中最多的一個科[25]. 外來物種入侵是導(dǎo)致正在進行的第六次物種大滅絕中的一個重要原因，最近的一項研究表明自1500年以來全球超過25%的植物物種滅絕和33%的動物物種滅絕源于外來物種入侵. 目前，生物入侵已成為當今世界的一個嚴重的環(huán)境問題[26-27]. 華蟹甲雖是中國分布的特有物種，但是其具有的有效的種子傳播和擴散機制、通過塊莖進行繁殖的良好集群能力，這些特征使華蟹甲具有非常強的擴散能力. 通過近幾年的野外調(diào)查，本課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)華蟹甲在七姊妹山國家級自然保護區(qū)的擴散趨勢逐年增強(未發(fā)表數(shù)據(jù)). 奧地利的研究者在近期的外來植物調(diào)查中也開始關(guān)注華蟹甲在當?shù)氐臄U張，華蟹甲作為一種觀賞植物在1970年被引入當?shù)厣絽^(qū)，基于華蟹甲在過去50年內(nèi)的擴散情況及其繁殖特性，作者建議對其進行監(jiān)控和管理[14]. 遺傳多樣性對外來物種的短期入侵成功和長期進化都具有重要的影響，弄清外來入侵物種的遺傳背景, 同時開展原產(chǎn)地和引入地之間的比較研究可以為物種管理提供科學(xué)的依據(jù)[26,28]. 因此成功篩選華蟹甲SSR引物也為該物種在引入地的管理提供科學(xué)參考依據(jù).