秦蘭 劉曉 李巍 費飛

摘要 目的：通過研究補(bǔ)腎活血方對原發(fā)性免疫性血小板減少癥（ITP）模型小鼠免疫系統(tǒng)的影響，探討補(bǔ)腎活血方治療ITP的效果及作用機(jī)制。方法：建立ITP小鼠模型，ELISA法檢測小鼠腸黏液中免疫球蛋白的含量及小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的變化;流式細(xì)胞儀檢測小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞周期及淋巴細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果：補(bǔ)腎活血方能夠顯著下調(diào)小鼠腸黏液中免疫球蛋白含量（P<0.05）;下調(diào)P53蛋白表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;顯著升高G0/G1期淋巴細(xì)胞比例（P<0.05），降低S期淋巴細(xì)胞比例（P<0.05），降低淋巴細(xì)胞凋亡率（P<0.05），對淋巴細(xì)胞周期異常分布及異常凋亡有一定的改善作用。結(jié)論：補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠有明顯的治療作用，其作用機(jī)制主要表現(xiàn)為下調(diào)ITP小鼠IgG、SIgA含量及淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)、改善ITP小鼠淋巴細(xì)胞周期異常分布、降低淋巴細(xì)胞凋亡率等，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究探索。

關(guān)鍵詞 原發(fā)性免疫性血小板減少癥;小鼠免疫球蛋白;P53蛋白;淋巴細(xì)胞周期;淋巴細(xì)胞凋亡率;中藥復(fù)方;腸道免疫;ITP小鼠模型

Effect of Bushen Huoxue Decoction on Intestinal Immunity and Lymphocyte in ITP Mice

QIN Lan，LIU Xiao，LI Wei，F(xiàn)EI Fei

（Hematology Department of the Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China）

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of Bushen Huoxue Decoction by studying the effect of Bushen Huoxue Decoction on ITP.Methods：the immune ITP model was established.The contents of immunoglobulin in intestinal mucus and the changes of P53 protein expression in mouse mesenteric lymph node lymphocytes were detected by ELISA.The changes of lymphocyte cycle and apoptosis rate in mesenteric lymph node were detected by flow cytometry.Results：Bushen Huoxue Decoction can significantly reduce the content of immunoglobulin in intestinal mucus of mice （P<0.05）.The expression of P53 protein decreased，which was significantly different from the model group （P<0.01）.The proportion of lymphocytes in G0/G1 stage significantly increased （P<0.05），the proportion of lymphocytes in S stage decreased （P<0.05），and the apoptosis rate of lymphocytes reduced （P<0.05），which indicated Bushen Huo xue Decoction was effective on the distribution of lymphocyte cycle and apoptosis.Conclusion：Bushen Huoxue Decoction has obvious therapeutic effect on ITP mice，the main mechanism of which is manifested on the down-regulation on the IgG and SIgA content of ITP mice and the expression of lymphocyte P53 protein，improvement of the distribution of lymphocyte cycle in ITP mice and reduction the apoptosis rate of lymphocyte，etc.The specific mechanism needs to be further explored.

Keywords Primary lmmune thrombocytopenia; Mouse immunoglobulin; P53 protein; Lymphocyte cycle; Apoptosis rate of lymphocytes; Chinese compound; Intestinal immunity; ITP mouse model

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.012

原發(fā)性免疫性血小板減少癥（Primary Immune Thrombocytopenia，ITP）是一種常見的出血性疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜出血，皮膚瘀點、瘀斑，可能伴有牙齦出血、鼻衄，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)內(nèi)臟及顱內(nèi)出血[1]。ITP發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，主要原因可能與免疫功能失調(diào)有關(guān)[2]。本實驗通過觀察補(bǔ)腎活血方對ITP模型小鼠腸黏液中免疫球蛋白的含量的變化、腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞周期的變化、淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡率的影響，探討補(bǔ)腎活血方治療對ITP小鼠免疫系統(tǒng)的作用效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/C小鼠，雌雄比例1∶1，平均體重（18±2）g，SPF級;購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-00058。動物飼養(yǎng)和實驗均在SPF級動物實驗室內(nèi)進(jìn)行。環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度40%～70%，光照12 h/12 h明暗交替環(huán)境，正常飲食。所有操作均嚴(yán)格按照中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則進(jìn)行（動物倫理審批號：XJMULA201903）。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎活血浸膏：制備方法：黃芪、生地黃、熟地黃、補(bǔ)骨脂、巴戟天、淫羊藿、山藥、山萸肉、龜甲膠、丹參、川芎、菟絲子、三七、雞血藤、女貞子、墨旱蓮、甘草，均由新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院提供，使用煎煮法提取至濃度為1.5 g/mL的補(bǔ)腎活血浸膏，備用。醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33021207）。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑：胎牛血清（GIBCO，美國，批號：16000-044）;抗生素（青鏈霉素）（GIBCO，美國，批號：15140-122）;DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，美國，批號：C11965500BT）;胰蛋白酶（GIBCO，美國，批號：25200-056）;PI碘化丙啶（Sigma公司，美國，批號：P4170）。主要儀器：移液器（EPPendorf公司，德國，型號：Researchplus）;CO2恒溫培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本，型號：MCO-20AIC）;超凈工作臺（Baker公司，美國，型號：BioChem GARD e3）;電熱恒溫水箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司，型號：HH·W21·600S）;倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：IX53）;血球計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司，型號：101010）;流式細(xì)胞儀（BD公司，美國，型號：BD Biosciences FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：實驗前從168只小鼠尾靜脈取血，用全自動血細(xì)胞計數(shù)儀檢測血小板數(shù)，按照血小板計數(shù)隨機(jī)分組，共隨機(jī)分為6組，每組24只小鼠。分別為正常組、模型組、陽性藥物潑尼松組、補(bǔ)腎活血高劑量組、補(bǔ)腎活血中劑量組和補(bǔ)腎活血低劑量組。2）ITP模型建立：使用BALB/C小鼠建立免疫性ITP小鼠模型（豚鼠抗小鼠血小板血清APS注射法），造模12、24、48 h后分別取小鼠尾靜脈血做血小板檢測觀察結(jié)果。使血小板在7 d內(nèi)維持原水平的30%左右，造成小鼠慢性持續(xù)性血小板減少ITP模型，造模8 d后開始給藥。

1.2.2 給藥方法 將168只小鼠隨機(jī)分為6組，每組24只。陽性藥物潑尼松組給藥劑量為0.2 mL/10 g;補(bǔ)腎活血高劑量組給藥劑量為0.4 mL/10 g;補(bǔ)腎活血中劑量組給藥劑量為0.2 mL/10 g;補(bǔ)腎活血低劑量組給藥劑量為0.1 mL/10 g;正常組、模型組分別給予藥物等體積的生理鹽水，造模8 d后每日灌胃1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 實驗結(jié)束后，處死小鼠，取小腸組織，制備勻漿，ELISA法檢測小鼠腸黏液中免疫球蛋白的含量的變化;FCM技術(shù)觀察小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞周期的變化;ELISA法檢測小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá);TUNEL法檢測小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用方差齊性檢驗和q檢驗，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠腸黏液中免疫球蛋白含量的影響 模型組lgG、SlgA都明顯高于正常組（P<0.01），潑尼松組lgG、SlgA與模型組比較均顯著降低（P<0.01），補(bǔ)腎活血高、中劑量組lgG、SlgA與模型組比較均顯著降低（P<0.05），說明補(bǔ)腎活血方能夠顯著下調(diào)小鼠腸黏液中免疫球蛋白含量。見表1。

2.2 補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞周期的影響 模型組G0/G1期淋巴細(xì)胞比例明顯低于正常組（P<0.05），G2/M期與S期淋巴細(xì)胞比例都明顯高于正常組（P<0.05），給藥后潑尼松組與模型組比較G0/G1期淋巴細(xì)胞比例有所升高，S期淋巴細(xì)胞比例與模型組比較有所降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)腎活血高劑量組與潑尼松組作用類似，與模型組比較，G0/G1期淋巴細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），S期淋巴細(xì)胞比例與模型組比較顯著降低（P<0.05）。G2/M期淋巴細(xì)胞比例低于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。補(bǔ)腎活血中、低劑量組與模型組比較雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但可以看出與高劑量組變化趨勢相同。說明補(bǔ)腎活血方治療后G0/G1期淋巴細(xì)胞比例有所提高，而G2/M期與S期淋巴細(xì)胞比例有所下降，雖沒有恢復(fù)到正常組水平，但補(bǔ)腎活血方給藥后對淋巴細(xì)胞周期分布有一定的改善作用。見表2。

2.3 補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響 模型組P53蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P<0.01），藥物干預(yù)后潑尼松組P53蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P<0.01），雖沒有達(dá)到正常組水平，但P53蛋白表達(dá)下調(diào)明顯。補(bǔ)腎活血高劑量組P53蛋白表達(dá)與模型組比較顯著降低（P<0.01），高劑量組與潑尼松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。補(bǔ)腎活血中、低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但P53蛋白表達(dá)較模型組有所下調(diào)，更接近正常組。說明補(bǔ)腎活血方給藥后能夠下調(diào)鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)。見表3。

2.4 補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞凋亡率的影響 模型組小鼠腸系膜淋巴細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組（P<0.01），潑尼松給藥后細(xì)胞凋亡率較模型組明顯下降（P<0.01），補(bǔ)腎活血高劑量組與模型組比較淋巴細(xì)胞凋亡率也有所下降（P<0.05），補(bǔ)腎活血中劑量組、低劑量組細(xì)胞凋亡率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但細(xì)胞凋亡率也有所下降。說明補(bǔ)腎活血方給藥后能夠降低淋巴細(xì)胞凋亡率。見表4。

3 討論

ITP中醫(yī)學(xué)統(tǒng)稱為“紫癜病”，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ITP的病機(jī)主要與脾、腎相關(guān)[3]，故而治療以“健脾補(bǔ)腎”為主，配合活血祛瘀法的治療方法在臨床上已經(jīng)取得了一定的療效[4-5]。補(bǔ)腎活血方以多年臨床經(jīng)驗為基礎(chǔ)，以“補(bǔ)腎活血”為治療原則，以黃芪、生地黃、熟地黃、補(bǔ)骨脂、巴戟天、淫羊藿、山藥、山萸肉、龜甲膠、丹參、川芎、菟絲子等藥物配伍，總結(jié)出補(bǔ)腎活血方，具有改善患者外周血小板數(shù)量、緩解出血癥狀的作用[6]。由于ITP的發(fā)病機(jī)制與自身免疫密切相關(guān)，當(dāng)ITP發(fā)病后，免疫系統(tǒng)表現(xiàn)為紊亂狀態(tài)，相關(guān)細(xì)胞因子異常分泌、T細(xì)胞亞群發(fā)生變化，導(dǎo)致免疫球蛋白異常、骨髓巨核細(xì)胞增殖異常等等[7-9]。補(bǔ)腎活血方在臨床上對ITP有良好的治療作用，故本實驗主要探究補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠免疫功能的影響。

免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）是血清抗體的主要成分。ITP發(fā)病機(jī)制與自身免疫密切相關(guān)，ITP患者血液中的IgG、SIgA均有異常升高的現(xiàn)象[10]。本實驗結(jié)果與之相符，ITP模型組小鼠與正常組比較，IgG、SIgA均顯著升高，補(bǔ)腎活血方給藥后ITP小鼠IgG、SIgA含量均有所下降，結(jié)果與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明補(bǔ)腎活血方能夠緩解ITP小鼠IgG、SIgA含量異常升高。

P53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，P53蛋白也與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，下調(diào)P53蛋白能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖[11]。本實驗中，ITP小鼠腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)與正常小鼠比較明顯升高，藥物干預(yù)后補(bǔ)腎活血高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)與模型組比較顯著降低，補(bǔ)腎活血中、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但P53蛋白表達(dá)較模型組也有所下調(diào)，更接近正常組，說明補(bǔ)腎活血方能夠下調(diào)P53蛋白異常表達(dá)，改善ITP小鼠癥狀。

細(xì)胞周期可分為G1期、G2期、S期及M期，其中相對靜止?fàn)顟B(tài)的G0/G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，G2期為DNA合成后期，M期為有絲分裂期。正常人淋巴細(xì)胞處于G0/G1期為主，S期及G2/M期細(xì)胞較少，而ITP患者淋巴細(xì)胞G0/G1期比例較低，而處于S期及G2/M期淋巴細(xì)胞比例較高，說明ITP患者淋巴細(xì)胞存在周期分布異常[12]。本實驗結(jié)果與這一現(xiàn)象相符，補(bǔ)腎活血方干預(yù)后，ITP小鼠淋巴細(xì)胞處于G0/G1期比例顯著升高，S期淋巴細(xì)胞比例與模型組比較顯著降低。G2/M期淋巴細(xì)胞低于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明補(bǔ)腎活血方能夠改善ITP小鼠淋巴細(xì)胞周期分布異常。另外，通過淋巴細(xì)胞凋亡率檢測，補(bǔ)腎活血方能夠明顯減低淋巴細(xì)胞凋亡率。說明補(bǔ)腎活血方能夠改善ITP小鼠淋巴細(xì)胞周期異常分布，降低淋巴細(xì)胞凋亡率。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方對ITP小鼠有明顯的治療作用，其作用機(jī)制主要表現(xiàn)為下調(diào)ITP小鼠IgG、SIgA含量及淋巴細(xì)胞P53蛋白表達(dá)、改善ITP小鼠淋巴細(xì)胞周期異常分布、降低淋巴細(xì)胞凋亡率等，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究探索。

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（2019-08-31收稿 責(zé)任編輯：蒼寧）