張 輝，張 爽，劉揚(yáng)帆，宋 菲，金成允

1.南陽(yáng)市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473000

2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院 研究室，河南 鄭州 450052

膀胱上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第2 位，是膀胱癌常見類型，占膀胱癌患者總數(shù)的90%以上[1]。目前BUC 治療主要采用以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案，但順鉑耐藥性導(dǎo)致BUC 化療敏感性低，治療效果不佳，患者2年生存率低[2-3]。因此，如何提高化療敏感性是目前BUC 治療中亟需解決的問題。紫草素是從天然紫草根部提取出的一種活性蒽醌衍生物，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[4-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紫草素對(duì)卵巢癌等多種癌細(xì)胞均具有抗增殖、提高順鉑敏感性的作用[6-7]。自噬是通過降解受損的細(xì)胞器、變性的蛋白質(zhì)等將能量再利用的過程，是細(xì)胞對(duì)抗不良生長(zhǎng)環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制，其發(fā)生可降低腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[8]。Kelch 樣 ECH 相關(guān)蛋白 1（Kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）/核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）通路是機(jī)體消除有害物質(zhì)損傷作用、維持氧化還原平衡的重要通路，可介導(dǎo)自噬反應(yīng)[9-10]。本研究基于Keap1/Nrf2通路介導(dǎo)的自噬探討紫草素對(duì)BUC 細(xì)胞化療敏感性的影響，以期為臨床提高BUC 化療敏感性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人膀胱乳頭狀移行上皮癌細(xì)胞BIU-87（貨號(hào)HZ-Y1072）購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)；順鉑（批號(hào)T1564，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司；紫草素（批號(hào)QY-0022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海喬羽生物科技有限公司；胎牛血清（貨號(hào)FBS500-S）購(gòu)自澳大利亞AusGeneX 公司；DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)KL-P0032）購(gòu)自德國(guó)Merck/Sigma公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)11668019）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（貨號(hào)K1002S）購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；negative control（NC）-Nrf2、hsa-Nrf2 mimic 及Nrf2、β-actin 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；CCK-8 試劑（貨號(hào)CK-04）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)S0185）購(gòu)自哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司；Keap1 抗體、Nrf2 抗體、GAPDH 抗體（貨號(hào)ab139729、ab89443、ab63817）購(gòu)自Abcam 公司；微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（貨號(hào)FNab04716）購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（貨號(hào)0295G-HRP）購(gòu)自美國(guó)Santa公司；TY10GI2-2 培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Shellab 公司；MODEL550 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；ABI7500 熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BIU-87 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代3 次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 順鉑對(duì) BIU-87 細(xì)胞增殖的影響 調(diào)整BIU-87 細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96 孔培養(yǎng)板，給予不同質(zhì)量濃度的順鉑（10、20、40、80、160 μg/mL）處理，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度（A）。以未給予順鉑處理細(xì)胞為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

細(xì)胞增殖抑制率＝(A對(duì)照－A給藥)/A對(duì)照

1.2.3 紫草素對(duì)順鉑處理的BIU-87 細(xì)胞增殖的影響 調(diào)整BIU-87 細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，在給予40 μg/mL 順鉑的基礎(chǔ)上給予不同濃度的紫草素（2、4、8、16、32 μmol/L）處理，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的A值。以未給予紫草素處理細(xì)胞為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BIU-87 細(xì)胞中Nrf2mRNA 表達(dá)情況 調(diào)整BIU-87 細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，設(shè)置對(duì)照組、順鉑組（40 μg/mL）、紫草素組（40 μg/mL順鉑＋8 μmol/L 紫草素）和NC 組（轉(zhuǎn)染NC-Nrf2＋40 μg/mL 順鉑＋8 μmol/L 紫草素）、Nrf2 組（轉(zhuǎn)染hsa-Nrf2 mimic＋40 μg/mL 順鉑＋8 μmol/L 紫草素）。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 法檢測(cè)Nrf2mRNA 表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。反應(yīng)程序：95 ℃、2 min，94 ℃、30 s，55 ℃、32 s，72 ℃、2 min，共循環(huán) 35 次。Nrf2上游引物：5’-ACGGGGCAGTCATGTACCA-3’，下游引物：5’-GTTGAAGAACTCCTCCTGCTTG-3’；內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物：5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTT-3’。Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.5 CCK-8 法檢測(cè)各組BIU-87 細(xì)胞增殖情況調(diào)整BIU-87細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，分組及給藥同“1.2.4”項(xiàng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 處的A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組BIU-87 細(xì)胞凋亡情況調(diào)整BIU-87細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板，分組及給藥同“1.2.4”項(xiàng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，胰酶消化，PBS 洗滌，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育1 h，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測(cè)各組BIU-87 細(xì)胞中Keap1/Nrf2 通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 調(diào)整BIU-87 細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，以每孔2 mL 接種于6 孔培養(yǎng)板，分組及給藥同“1.2.4”項(xiàng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加蛋白裂解液，離心收集蛋白并定量，取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Keap1 抗體（1∶300）、Nrf2 抗體（1∶300）、LC3 抗體（1∶300）、GAPDH 抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，1∶2000），室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光，Image J 軟件分析條帶灰度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對(duì)BIU-87 細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，10、20、40、80、160 μg/mL順鉑處理下BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），半數(shù)抑制濃度（IC50）在20～40 μg/mL內(nèi)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中順鉑處理質(zhì)量濃度均采用40μg/mL。見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度順鉑處理下BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率(x± s,n＝6)Fig.1 Proliferation inhibition rate of BIU-87 cells treated with different concentrations of cisplatin(±s,n=6)

2.2 不同濃度紫草素對(duì)順鉑處理下BIU-87 細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，2、4、8、16、32 μmol/L 紫草素聯(lián)合順鉑處理下BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），IC50在4～8 μmol/L 內(nèi)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)紫草素處理濃度均采用8 μmol/L。見圖2。

圖2 不同濃度紫草素聯(lián)合順鉑處理下BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率(±s,n=6)Fig.2 Proliferation inhibition rate of BIU-87 cells treated with cisplatin and shikonin at different concentrations(±s,n=6)

2.3 轉(zhuǎn)染后BIU-87 細(xì)胞Nrf2 mRNA 表達(dá)情況

紫草素組、NC 組BIU-87 細(xì)胞中Nrf2mRNA表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NC組相比，Nrf2 組BIU-87 細(xì)胞中Nrf2mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后BIU-87 細(xì)胞Nrf2 mRNA 表達(dá)水平(±s,n=6)Fig.3 Nrf2 mRNA expression level in BIU-87 cells after transfection(±s,n=6)

2.4 轉(zhuǎn)染后BIU-87 細(xì)胞增殖、凋亡情況

與對(duì)照組相比，順鉑組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4 各組BIU-87 細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of BIU-87 cells in each group

圖5 各組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率Fig.5 Proliferation inhibition rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group

2.5 轉(zhuǎn)染后BIU-87細(xì)胞中Keap1/Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，順鉑組BIU-87 細(xì)胞中Keap1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細(xì)胞中Keap1、Nrf2 蛋白表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組BIU-87 細(xì)胞中Keap1、Nrf2 蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of KEAP1 and Nrf2 protein in BIU-87 cells in each group

2.6 各組BIU-87 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，順鉑組BIU-87 細(xì)胞中LC3I蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3II蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細(xì)胞中LC3I蛋白表達(dá)水平顯著升高，LC3II蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細(xì)胞中LC3I、LC3II蛋白表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細(xì)胞中LC3I蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3II蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組BIU-87 細(xì)胞中LC3?、LC3II 蛋白表達(dá)情況Fig.7 Expression of LC3? and LC3II protein in BIU-87 cells in each group

3 討論

化療是治療各種癌癥的重要手段之一，其療效經(jīng)過長(zhǎng)期廣泛地研究驗(yàn)證，而腫瘤化療的敏感性與患者的預(yù)后及生存質(zhì)量息息相關(guān)[11]。順鉑是BUC化療的一線基礎(chǔ)治療藥物，在使用過程中，BUC 易對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療敏感性不高，影響治療效果[12]。此外，BUC 作為一種具有復(fù)發(fā)傾向的惡性腫瘤，在接受多次、長(zhǎng)期化療后，對(duì)化療藥物的敏感性也會(huì)逐漸降低，最終影響治療效果[13]。因此，尋找合適的治療藥物提高BUC 化療敏感性具有重要意義。本研究通過設(shè)置順鉑質(zhì)量濃度梯度，發(fā)現(xiàn)BIU-87 細(xì)胞的順鉑IC50在20～40 μg/mL，故最終選定40 μg/mL 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中順鉑的處理濃度。

近年來，中藥在腫瘤治療中的作用越來越受到重視，許多抗腫瘤藥物均來自中藥提取物。紫草素是中藥紫草的主要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合等一系列生物學(xué)特性[14-15]。目前，紫草素的抗腫瘤作用已在許多腫瘤中得到證實(shí)，其在腫瘤治療中的作用日益受到重視。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能通過調(diào)節(jié)微小RNA-106b（miR-106b）/第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog gene deleted on chromosome 10，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinaseb B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Zhang 等[17]研究表明，紫草素類衍生物脫氧紫草素通過抑制Akt 信號(hào)介導(dǎo)的ATP 結(jié)合盒亞家族B成員1（ATP-binding cassette subfamily B member 1 transporter gene，ABCB1）表達(dá)來抑制NSCLC 細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。Shilnikova 等[7]發(fā)現(xiàn)紫草素能誘導(dǎo)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡。許靜等[18]研究表明，紫草素可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌SKOV3/DDP 細(xì)胞的順鉑耐藥效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與單獨(dú)順鉑處理相比，使用2、4、8、16、32 μmol/L 紫草素均可進(jìn)一步提高BIU-87 細(xì)胞的增殖抑制率，紫草素組BIU-87 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率較順鉑組均顯著升高，提示紫草素可以提高BIU-87 細(xì)胞的順鉑敏感性，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

細(xì)胞自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、生存的重要過程，利用溶酶體清除損傷、多余的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器并將能量供給自身再利用，在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)起重要的防御作用[19]。然而，腫瘤細(xì)胞也能利用該過程在化療中保護(hù)自身，影響化療敏感性。石瑛等[20]研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬可增強(qiáng)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。張建育等[21]研究表明，二十碳五烯酸可能通過抑制自噬反應(yīng)提高膀胱癌細(xì)胞的順鉑化療敏感性。殷雷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子圓柱瘤基因CYLD能通過抑制自噬提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性。LC3 是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中以LC3I、LC3II 2 種形式存在，在自噬過程中由LC3I轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3II，進(jìn)而與自噬體特異性結(jié)合[23]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組BIU-87 細(xì)胞中LC3II蛋白表達(dá)水平顯著升高，LC3I蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示BIU-87 細(xì)胞在抵御順鉑作用時(shí)發(fā)生了自噬反應(yīng)；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87 細(xì)胞中LC3II蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3I蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示紫草素可以通過抑制BIU-87 細(xì)胞的自噬反應(yīng)，進(jìn)而加強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

Keap1/Nrf2 通路是調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激的重要通路。在正常生理狀態(tài)下，Keap1 和Nrf2 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合體，并介導(dǎo)泛素化持續(xù)降解Nrf2，以維持轉(zhuǎn)錄形成的Nrf2 之間的平衡。在應(yīng)激條件下，Keap1中的半胱氨酸殘基發(fā)生修飾，導(dǎo)致Keap1 構(gòu)象發(fā)生改變，Nrf2 從Keap1/Nrf2 復(fù)合物中分離且不會(huì)被泛素化和降解，通過影響多種自噬凋亡基因的轉(zhuǎn)錄參與自噬調(diào)節(jié)[24-25]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑組BIU-87 細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示順鉑可激活Keap1/Nrf2 通路；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示紫草素可抑制Keap1/Nrf2 通路激活，推測(cè)紫草素可能通過影響Keap1/Nrf2 通路影響細(xì)胞自噬反應(yīng)，進(jìn)而影響B(tài)IU-87 細(xì)胞的順鉑敏感性。本研究在順鉑聯(lián)合紫草素處理基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞上調(diào)Nrf2 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BIU-87細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低，細(xì)胞中Keap1、LC3I蛋白表達(dá)水平顯著降低，Nrf2、LC3II蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示激活Keap1/Nrf2 通路后，BIU-87 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，細(xì)胞自噬反應(yīng)增強(qiáng)，推測(cè)紫草素增強(qiáng)BIU-87 細(xì)胞的順鉑敏感性可能是通過抑制Keap1/Nrf2 通路激活，進(jìn)而抑制自噬反應(yīng)發(fā)揮作用的。

綜上所述，紫草素可以增強(qiáng)BUC 細(xì)胞BIU-87對(duì)順鉑的敏感性，可能是通過抑制Keap1/Nrf2通路介導(dǎo)的自噬反應(yīng)發(fā)揮作用的。但本研究?jī)H針對(duì)BIU-87 細(xì)胞，在其他BUC 細(xì)胞系中的作用還需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突