楊秀偉，周琪樂，楊雁芳，張友波，徐 嵬

北京大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系 天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

口服給藥是臨床上最常用的給藥方式，具有相對(duì)安全以及患者依從性好等優(yōu)勢(shì)。藥物經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)主要是通過小腸吸收，而腸上皮細(xì)胞屏障及酶系統(tǒng)是決定藥物吸收程度的關(guān)鍵因素之一。從20世紀(jì)80年代，國(guó)外開始應(yīng)用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系（human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2）細(xì)胞建立藥物腸吸收的體外模型，目前已被廣泛應(yīng)用于藥物的體外吸收評(píng)價(jià)研究。Caco-2細(xì)胞來源于人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化并可形成緊密聯(lián)結(jié)，其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)及滲透特征與小腸類似，具有易于培養(yǎng)、同源性好、體外吸收實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[1]。

人參是馳名中外的大補(bǔ)中藥之一，最簡(jiǎn)單的用藥形式是“獨(dú)參湯”，復(fù)雜的用藥形式是通過辨證與其他中藥配伍成復(fù)方應(yīng)用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參中的三萜類成分，包括其皂苷[2]，幾乎反映了人參的全部藥物學(xué)作用[3]。但有關(guān)紅參中三萜類化合物的腸吸收評(píng)價(jià)研究甚少。眾所周知，中藥發(fā)揮療效是其多成分協(xié)同作用的結(jié)果，單一活性成分的腸吸收不能完全反映單味藥或其復(fù)方的腸吸收情況，因此中藥單味藥或復(fù)方的腸吸收研究是必要的。針對(duì)中藥提取物腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)后待測(cè)物富集難、微量成分難檢測(cè)的問題，本課題組建立了鼠尾膠原包被且給樣量大的6 孔板Caco-2細(xì)胞單層模型[4]。為了從整體評(píng)價(jià)紅參提取物復(fù)雜成分的腸吸收情況，本研究采用國(guó)際上公認(rèn)的可以模擬小腸上皮細(xì)胞的Caco-2細(xì)胞單層模型（6 孔Transwell 板），對(duì)紅參水煎液提取物的正丁醇萃取部位（人參總皂苷部分）進(jìn)行體外小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)研究，探索紅參中人參三萜類成分在紅參整體給藥方式下的腸吸收情況，為紅參的臨床合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞株（ATCC #HTB-37）購自美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。

1.2 藥品及主要試劑

紅參樣品由長(zhǎng)春加一健康食品有限公司（長(zhǎng)春）提供，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院楊秀偉教授鑒定系由人參Panax ginsengC.A.Meyer 的根和根莖加工制成的紅參，憑證標(biāo)本（No.20131201JLRG）存放在北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

受試化合物對(duì)照品人參皂苷（G）-Ra1（1）[5]、G-Ra2（2）、G-Rb1（3）、G-Rb2（4）、G-Rb3（5）、G-Rc（6）、G-Rd（7）、G-Re（8）、G-Rg1（9）、G-Rg5（10）、G-Rg6（11）、G-Rg9（12）、G-Rh4（13）、G-Rk1（14）、G-Rk3（15）、G-Rs1（16）、G-Rs2（17）、G-Rs4（18）、G-F4（19）、G-Ro（20）、G-Ro 甲酯（21）、20-glu-G-Rf（22）、20(S)-G-Rf（23）、20(R)-G-Rf（24）、20(S)-G-Rg2（25）、20(R)-G-Rg2（26）、20(S)-G-Rg3（27）、20(R)-G-Rg3（28）、20(S)-G-Rh1（29）、20(R)-G-Rh1（30）、20(S)-G-Rs3（31）、20(R)-G-Rs3（32）、20(S)-NG-R2（33）、20(R)-NG-R2（34）、NG-R1（35）[6]、20(S)-G-Rf2（36）、20(R)-G-Rf2（37）、20(S)-PPT（38）、20(R)-PPT（39）[7]，由本課題組從生曬參或紅參或人參莖葉中分離得到；竹節(jié)參皂苷IVa（CS-IVa，40，批號(hào)PS 14052106）購自成都普思生物科技有限公司；擬人參皂苷RT5（PG-RT5，41，批號(hào)MUST 15041410）和F11（PG-F11，42，批號(hào)MUST 15020311）購自成都曼思特生物科技有限公司。42 個(gè)化合物的對(duì)照品經(jīng)HPLC 檢測(cè)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 人參三萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ginseng triterpenoids

DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，批號(hào)8120426）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào) 1872295）、非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA，批號(hào)2188976）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA，批號(hào) 2192749）和青霉素（penicillin）-鏈霉素（streptomycin）雙抗（批號(hào)2257205）購自美國(guó)Gibco公司；Hank’s 緩沖溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國(guó)Sigma 公司；乙腈和甲醇均為質(zhì)譜級(jí)（美國(guó)Avantor Performance Materials，Inc.）；乙酸銨（HPLC 級(jí)，LOT# BCBK6717V，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。6 孔聚碳酯膜轉(zhuǎn)運(yùn)板（Transwell，#3414）、15 及50 mL 塑料離心管和25 cm2及75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶等均購自美國(guó)Corning Costar 公司。I型鼠尾膠原（RTC，批號(hào)SLBW1777）購自德國(guó) Sigma 公司。實(shí)驗(yàn)用水由 Milli-Q Advantage A10 制水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）制備。

1.3 儀器

GALAXY B型CO2氣體培養(yǎng)箱（英國(guó)RS Biotech公司）、JJT-1300 型超凈工作臺(tái)（北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化公司）、Evom 細(xì)胞電阻儀（美國(guó)World PrecisionInstrument 公司）、XDS-1 倒置顯微鏡（重慶光電儀器總公司）、GRX-9051B 型熱空氣消毒箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、座式蒸汽壓力滅菌鍋（上海龍杰機(jī)械裝備有限公司）、HZS-H 型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、TDL-5-A型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），LGJ0.5 冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）。

島津LCMS-8050 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，包括Nexera X2 UFLC 液相系統(tǒng)、LC-30AD 二元泵、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A 檢測(cè)器和CTO-20AC 柱溫箱，以及8050 型三重四級(jí)桿定量質(zhì)譜，配備ESI離子源和LabSolution 工作站（日本島津公司）。Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，愛爾蘭Waters 公司）；配備Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18VanGuardTM預(yù)柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm，愛爾蘭Waters 公司）。PALLAS 3.3.2.6 ADME/Tox 預(yù)測(cè)軟件（CompuDrug Chemistry Ltd.）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)液和緩沖溶液的配制

完全DMEM 培養(yǎng)液-10、HBSS 平衡鹽溶液、磷酸緩沖液（PBS）的配制參考文獻(xiàn)方法[8]。

2.2 膠原包被Transwell 嵌套

用無菌水配制2 mg/mL 鼠尾膠原儲(chǔ)備液，按10 μg/cm2配制鼠尾膠原包被工作液。

2.3 紅參總皂苷（總?cè)疲┨崛∥飪龈煞鄣闹苽?/h3>

取紅參水煎液的正丁醇萃取物[6]少量，加適量水分散，經(jīng)冷凍干燥后得紅參總皂苷提取物凍干粉。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和種板

從液氮中取出凍存的Caco-2細(xì)胞，以完全DMEM-10 培養(yǎng)復(fù)蘇，待細(xì)胞穩(wěn)定后，每4～5 天傳代（細(xì)胞匯合率約80%），傳代比例為1∶5。取鼠尾膠原包被工作液0.6 mL加入到6孔板的Transwell嵌套中，在超凈臺(tái)中放置2 h，使其干燥并部分包被。吸走嵌套中剩余的膠原溶液，立即用1 mL PBS 漂洗后，嵌套即可使用。細(xì)胞匯合率達(dá)到80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶瓶壁上消化下來，用完全DMEM-10 終止消化并將細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)稀釋到2.5×105個(gè)/mL。向6 孔板的底端（basolateral，BL）側(cè)加入2.6 mL 完全DMEM-10培養(yǎng)液，向孔板的頂端（apical，AP）側(cè)加入1.5 mL已充分混勻的細(xì)胞懸液。為避免培養(yǎng)初期死細(xì)胞堵塞膜表面，種板后的第1、3 天換液時(shí)先換AP 側(cè)；第5 天以后細(xì)胞膜已基本形成。為避免暴露在空氣中時(shí)間過長(zhǎng)，換液時(shí)先換BL 側(cè)。

2.5 Caco-2細(xì)胞單層完整性的考察

按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[4]方法，用電阻儀測(cè)定6 孔Transwell 中的Caco-2細(xì)胞單層電阻值，以確定單層細(xì)胞的緊密性與完整性。本實(shí)驗(yàn)所用6 孔細(xì)胞單層的電阻值均大于800 Ω·cm2。

2.6 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 紅參總?cè)铺崛∥锕┰嚻返呐渲?本實(shí)驗(yàn)劑量選擇根據(jù)紅參中的特征性成分之一G-Rg5的含量來換算，依據(jù)單體化合物的Caco-2細(xì)胞單層評(píng)價(jià)給藥劑量，設(shè)計(jì)G-Rg5給藥劑量為50 μmol/L，實(shí)驗(yàn)前用DMSO 配制成5 mmol/L 儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)再以HBSS 緩沖液稀釋100 倍；換算成紅參總?cè)铺崛∥锏慕o藥劑量為3.472 mmol/L，即準(zhǔn)確稱取紅參總皂苷提取物凍干粉133.3 mg 溶于500 μL 的DMSO中配制成儲(chǔ)備液，作為測(cè)試液。

2.6.2 紅參總?cè)铺崛∥锏霓D(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)的第21 天取出6 孔Caco-2細(xì)胞單層Transwell 板，測(cè)定單層細(xì)胞電阻后，用37 ℃的HBSS 緩沖液洗滌AP側(cè)和BL側(cè)各2次，之后補(bǔ)加HBSS（AP側(cè)加1500 μL，BL 側(cè)加2600 μL），在恒溫水浴搖床上溫育（37 ℃、50 r/min），30 min 后取出，再次測(cè)定單層細(xì)胞的電阻值以確定其緊密性與完整性。然后吸走HBSS 溶液（保存、備用），根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在單層細(xì)胞的兩側(cè)加入測(cè)試液和HBSS 溶液：轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，AP側(cè)向BL 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)（AP→BL），AP 側(cè)加測(cè)試液1500 μL，BL 側(cè)加空白HBSS 溶液2600 μL；外流實(shí)驗(yàn)時(shí)，BL側(cè)向AP 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)（BL→AP），BL 側(cè)加測(cè)試液2600 μL，AP 側(cè)加空白HBSS 溶液1500 μL。加好后置于恒溫水浴搖床溫育（37 ℃、50 r/min）。90 min 后，取出Transwell 板，收集AP 側(cè)和BL 側(cè)的溶液。轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，給藥側(cè)AP 取樣500 μL，接收側(cè)BL 取樣2300 μL；外流實(shí)驗(yàn)時(shí)，給藥側(cè)BL 取樣500 μL，接收側(cè)AP 取樣1300 μL。樣品用封口膜封口、扎孔，然后置于-20 ℃冰箱冷凍保存，待測(cè)。

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 樣品處理 Caco-2細(xì)胞單層過膜樣品經(jīng)冷凍干燥后，BL 側(cè)樣品各加入300 μL 甲醇復(fù)溶，AP側(cè)樣品各加入200 μL 甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，混勻后超聲溶解10 min，再經(jīng)15 000×g離心10 min，取上清，進(jìn)樣預(yù)設(shè)的LC-MS/MS 系統(tǒng)測(cè)定。

2.7.2 混合對(duì)照品的制備 精密稱取上述42 個(gè)人參三萜皂苷對(duì)照品適量，用甲醇超聲溶解制得除20(R)-G-Rg3（0.2 mg/mL）外，質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成含1 μg/mL 的20(S)-G-Rh1、G-Rg6、20(S)-NG-R2、20(S)-G-Rg2、G-Rb3、G-Ra2、20(R)-GRg3，500 ng/mL 的20(R)-G-Rh1、20(R)-G-Rg2、G-Rs2、G-Rs1、NG-R1、20-glu-G-Rf、竹節(jié)參皂苷IVa、20(S)-G-Rg3、G-Rg9、20(S)-PPT、20(R)-PPT、G-Rk3，4 μg/mL 的G-F4、G-Rs4、G-Rh4，2 μg/mL 20(S)-G-Rf、G-Re、G-Rk1，200 ng/mL 的20(R)-G-Rf、20(R)-NG-R2、20(S)-G-Rf2、20(R)-G-Rf2，250 ng/mL 的G-Ro 甲酯、G-Ra1、PG-F11、G-RT5、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3，5 μg/mL 的G-Rd、G-Ro、G-Rb1、G-Rb2、G-Rc、G-Rg1、G-Rg5的混合對(duì)照品溶液。

2.7.3 色譜-質(zhì)譜條件 液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)為島津LCMS-8050 系列，色譜條件以及質(zhì)譜參數(shù)與紅參藥動(dòng)學(xué)的分析方法[9]完全一致，本實(shí)驗(yàn)中利用三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定42 個(gè)人參三萜成分設(shè)定的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）離子對(duì)及一級(jí)四極桿預(yù)偏置電壓（Q1 pre bias）、三級(jí)四極桿預(yù)偏置電壓（Q3 pre bias）、碰撞能量（CE）等參數(shù)與紅參藥材含量測(cè)定的MRM 參數(shù)[10]一致，除了滯留時(shí)間（dwell time，DT）略有調(diào)整外，由于更換預(yù)柱，各化合物的保留時(shí)間（tR）亦略有變化。色譜-質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各分析物的色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Chromatography-mass spectrometry parameters of each analyte

2.7.4 工作曲線的繪制 將混合對(duì)照品溶液用第3次洗滌細(xì)胞的HBSS 緩沖液倍比稀釋成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，冷凍干燥后，甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，混勻后超聲溶解20 min，再經(jīng)16 000×g離心10 min，取上清2 μL 在既定的LC-MS 條件[10]下進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），得到各對(duì)照品的線性回歸方程（表2）。

表2 各分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、r2 和線性范圍Table 2 Calibration curve,coefficient and linear range of each analyt e

2.7.5 精密度、準(zhǔn)確度、回收率 用HBSS 緩沖溶液將各對(duì)照品配制成低、中、高3 個(gè)濃度的混標(biāo)溶液，凍干后甲醇復(fù)溶，漩渦2 min，混勻后超聲溶解10 min，在15 000×g條件下離心10 min，取上清液進(jìn)樣LC-MS 系統(tǒng)檢測(cè)。1 d 內(nèi)連續(xù)測(cè)定3 次，根據(jù)各分析物峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；1周內(nèi)連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)各化合物峰面積計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度（表3）。取0.5 mL 空白HBSS 溶液，精密加入適量高、中、低3 個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液（n＝6），分別用上述方法處理，進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積為A1；另取等量的高、中、低3 個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液（n＝6），補(bǔ)足相同體積的甲醇，直接進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積為A2，計(jì)算回收率（回收率＝A1/A2）。見表3。

表3 各分析物的日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度以及回收率(n =6)Table 3 Intra-and inter-day precision,accuracy and recovery for 42 analytes(n =6)

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

2.7.6 質(zhì)控樣品制備 按照“2.7.4”項(xiàng)下方法制備得到系列濃度（7 個(gè)質(zhì)量濃度）的混合對(duì)照品溶液，取2、5、7 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)平行制備6 份樣品，即為低、中、高濃度的質(zhì)控樣品。

2.7.7 穩(wěn)定性 常溫穩(wěn)定性：將高、中、低3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品室溫密封放置 24 h，測(cè)定其濃度；凍融循環(huán)穩(wěn)定性：將高、中、低3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品經(jīng)反復(fù)3 次-20 ℃冰凍-室溫溶解后，測(cè)定其濃度；長(zhǎng)期穩(wěn)定性：將高、中、低3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品置于-20 ℃下1 個(gè)月，測(cè)定其濃度。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，高、中、低質(zhì)控樣品的常溫穩(wěn)定性（RSD 值為0.86%～1.68%）、凍融循環(huán)穩(wěn)定性（RSD 值為4.11%～1.93%）及長(zhǎng)期穩(wěn)定性（RSD 值為1.22%～3.98%）滿足生物樣品分析的相關(guān)要求。

2.8 表觀滲透系數(shù)（Papp）計(jì)算和數(shù)據(jù)處理

受試分析物在Caco-2細(xì)胞單層模型中的Papp值按公式計(jì)算。每數(shù)據(jù)點(diǎn)為平行3 孔的平均值，用±s表示。

Papp＝dQ/dt×1/A×1/C0Q為累積轉(zhuǎn)運(yùn)量，代表分析物在接收室出現(xiàn)的總量（μmol/L）；dQ/dt表示速率（μmol/L·s）；C0為分析物在給藥室的初始濃度（μmol/L·cm）；A為聚碳酯膜的表面積（cm2）

3 結(jié)果

3.1 MRM 色譜圖

42 個(gè)人參三萜混合對(duì)照品的MRM 疊加色譜圖、Caco-2 單層過膜前紅參總?cè)藚⑷铺崛∥锏腗RM離子對(duì)色譜圖以及紅參總?cè)藚⑷七^膜后AP側(cè)和BL 側(cè)的MRM 疊加色譜圖分別見圖2-A～D，如圖2所示，每個(gè)MRM 通道上的同分異構(gòu)體都能達(dá)到滿意的分離度。

圖2 紅參提取物過膜前后及其代表性的42 個(gè)三萜類化合物的MRM 色譜圖Fig.2 Typical MRM chromatograms for Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extracts before and after membrane crossing and 42 representative triterpenes of Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extracts

3.2 紅參總?cè)铺崛∥镛D(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

紅參中42 個(gè)人參三萜類化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和外流的Papp值和PappAP→BL/PappBL→AP值見表4。從表4 結(jié)果可見，紅參中絕大多數(shù)人參三萜的Papp值在8×10-7～9×10-6cm/s，預(yù)測(cè)它們經(jīng)腸道吸收程度為中等或不良。從總體趨勢(shì)可以看出，人參皂苷苷元PPT最容易被吸收，然后是單糖苷，諸如G-Rb1、G-Rc的四糖苷和G-Ra1、G-Ra2的五糖苷等則很難被吸收。

表4 紅參提取物中42 個(gè)人參三萜類成分在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)和外流的Papp 值(±s,n=3)Table 4 Papp Values of transport and efflux of 42 triterpenes in Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extract by Caco-2 cell monolayer model(±s,n=3)

表4 紅參提取物中42 個(gè)人參三萜類成分在Caco-2細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)和外流的Papp 值(±s,n=3)Table 4 Papp Values of transport and efflux of 42 triterpenes in Ginseng Radix et Rhizoma Rubra extract by Caco-2 cell monolayer model(±s,n=3)

人參三萜 Papp AP→BL/(cm·s-1)Papp BL→AP/(cm·s-1)PappAP→BL/PappBL→AP 人參三萜 Papp AP→BL/(cm·s-1)Papp BL→AP/(cm·s-1)PappAP→BL/PappBL→AP G-Ra1（1.01±0.15）×10-7（0.98±0.12）×10-7 0.97 20(S)-G-Rh1（1.65±0.19）×10-6（1.92±0.23）×10-61.17 G-Ra2（1.06±0.13）×10-7（0.90±0.08）×10-7 0.85 20(R)-G-Rh1（2.03±0.29）×10-6（2.40±0.34）×10-61.18 G-Rb1（2.06±0.32）×10-7（1.81±0.19）×10-7 0.88 G-Rh4（5.18±0.54）×10-6（4.48±0.47）×10-60.87 G-Rb2（2.70±0.34）×10-7（2.54±0.24）×10-7 0.94 G-Rk1（4.03±0.26）×10-7（3.71±0.15）×10-70.92 G-Rb3（2.53±0.12）×10-7（2.68±0.13）×10-7 1.06 G-Rk3（5.68±0.60）×10-6（5.34±0.57）×10-60.94 G-Rc（2.43±0.11）×10-7（2.11±0.29）×10-7 0.87 G-Rs1（2.63±0.17）×10-7（2.36±0.16）×10-70.90 G-Rd（3.41±0.53）×10-7（2.86±0.29）×10-7 0.84 G-Rs2（2.59±0.45）×10-7（2.31±0.42）×10-70.89 G-Re（4.16±0.44）×10-7（5.19±0.58）×10-7 1.25 20(S)-G-Rs3（2.98±0.25）×10-7（2.79±0.21）×10-70.94 20(S)-G-Rf（4.78±0.39）×10-7（6.14±0.52）×10-7 1.29 20(R)-G-Rs3（2.40±0.14）×10-7（2.83±0.13）×10-71.18 20(R)-G-Rf（4.36±0.71）×10-7（5.84±0.69）×10-7 1.34 G-Rs4（1.16±0.10）×10-7（1.28±0.09）×10-71.10 20-glu-G-Rf（4.48±0.34）×10-7（4.75±0.75）×10-7 1.06 G-F4（6.03±0.47）×10-7（5.61±0.63）×10-70.93 20(S)-G-Rf2（4.94±0.65）×10-7（6.72±0.48）×10-7 1.36 NG-R1（3.88±0.14）×10-7（5.27±0.47）×10-71.36 20(R)-G-Rf2（5.31±0.29）×10-7（7.60±0.53）×10-7 1.43 20(S)-NG-R2（5.10±0.41）×10-7（6.45±0.54）×10-71.26 G-Rg1（5.22±0.32）×10-7（7.12±0.87）×10-7 1.36 20(R)-NG-R2（5.06±0.34）×10-7（5.78±0.46）×10-71.14 20(S)-G-Rg2（4.23±0.29）×10-7（5.11±0.31）×10-7 1.21 20(S)-PPT（8.04±0.69）×10-6（9.81±0.52）×10-61.22 20(R)-G-Rg2（6.11±0.83）×10-7（7.43±0.75）×10-7 1.22 20(R)-PPT（9.10±0.43）×10-6（1.06±0.05）×10-51.17 20(S)-G-Rg3（4.08±0.27）×10-7（3.63±0.16）×10-7 0.89 PG-F11（4.12±0.25）×10-7（7.09±0.49）×10-71.72 20(R)-G-Rg3（1.35±0.11）×10-7（1.66±0.08）×10-7 1.23 PG-RT5（1.16±0.18）×10-6（1.49±0.23）×10-61.28 G-Rg5（3.84±0.21）×10-7（4.42±0.18）×10-7 1.15 CS-IVa（3.57±0.20）×10-7（3.09±0.48）×10-70.87 G-Rg6（5.28±0.35）×10-7（4.70±0.41）×10-7 0.89 G-Ro（3.17±0.41）×10-7（2.62±0.35）×10-70.83 G-Rg9（4.34±0.12）×10-7（4.88±0.13）×10-7 1.13 G-Ro 甲酯（2.75±0.19）×10-7（2.12±0.17）×10-70.77

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅參中人參三萜提取物進(jìn)行了Caco-2細(xì)胞單層模型吸收轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)價(jià)研究，利用UFLC-MS/MS 高靈敏度等優(yōu)勢(shì)對(duì)紅參過膜樣品中的42 個(gè)人參三萜同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定。在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人參三萜吸收程度為中等或不良，唯有2 個(gè)人參三萜皂苷元20(S)-PPT 和20(R)-PPT吸收程度良好（Papp值接近1×10-5cm/s）；此外，發(fā)現(xiàn)人參皂苷20(S)-G-Rh1、20(R)-G-Rh1、G-Rk3、G-Rh4、PG-RT5這5 個(gè)單糖苷的Papp值均在1×10-6cm/s 數(shù)量級(jí)，提示它們吸收程度為中等[11]。G-Rk3、G-Rh4的吸收強(qiáng)弱程度是G-Rh1的2～3 倍，前者化學(xué)結(jié)構(gòu)僅是C17側(cè)鏈比G-Rh1多了1 個(gè)雙鍵。隨著人參三萜皂苷糖取代基數(shù)目的增多，其Papp值越來越小，提示多糖苷的人參三萜皂苷在體內(nèi)很難被吸收。在所有考察的 42 個(gè)人參三萜中，二糖苷20(R)-G-Rg3的Papp值相對(duì)較小，推測(cè)可能與其溶解度有關(guān)，20(R)-G-Rg3在甲醇中微溶，在水中幾乎不溶，雖然其在紅參水煎液中含量不低，但在過膜實(shí)驗(yàn)中，并不能完全以分子狀態(tài)透過膜。在Caco-2細(xì)胞單層過膜吸收評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，所考察的42 個(gè)人參三萜還包括了8 對(duì)R、S異構(gòu)體，結(jié)果顯示R/S異構(gòu)體的吸收情況并沒有顯著性差異。以上結(jié)果相對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的單體人參皂苷給藥量大多一致[12-18]，存在少數(shù)的波動(dòng)，推測(cè)紅參總?cè)铺崛∥镏谢衔镏g可能存在著相互作用。實(shí)際上，口服人參皂苷會(huì)經(jīng)腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化為少糖基的人參皂苷[19]（即所謂的稀有人參皂苷）吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用[20]，由此推測(cè)人參三萜皂苷是前藥（pro-drug）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為確定紅參的有效成分[21-22]提供了腸吸收方面的科學(xué)依據(jù)。結(jié)果提示，人參如果配伍能夠促進(jìn)腸內(nèi)細(xì)菌活躍、分泌大量能夠水解人參皂苷的水解酶的中藥，使多糖基人參皂苷水解為少糖基皂苷或苷元而吸收進(jìn)入體循環(huán)，更有益于發(fā)揮人參三萜的生物學(xué)活性[3,23]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突