李建萍，徐雪君，張沁瑜，郭建明*，段金廒*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023

藥物相互作用是指2 種或者2 種以上的藥物聯(lián)合使用時藥物之間產(chǎn)生的相互影響，主要包括藥效學(xué)相互作用和藥動學(xué)相互作用。潛在的藥物相互作用會對藥物的安全性和有效性產(chǎn)生巨大的影響。例如，米貝拉地爾與辛伐他汀聯(lián)合用藥會產(chǎn)生橫紋肌溶解的風(fēng)險，因為米貝拉地爾可顯著抑制細(xì)胞色素P450 酶的代謝能力，導(dǎo)致辛伐他汀的暴露量增加，在無法控制藥物相互作用風(fēng)險的情況下，米貝拉地爾已經(jīng)被撤出了醫(yī)藥市場[1]。又如，丙磺舒與青霉素聯(lián)合用藥會產(chǎn)生抗菌作用增強的效應(yīng)，因為丙磺舒可顯著抑制有機陰離子轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運功能，導(dǎo)致青霉素的排泄減少[2]。因此，明確潛在的藥物相互作用及機制，對于確保臨床用藥的安全性和有效性具有重要意義。

阿司匹林（aspirin，acetylsalicylic acid）是經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛、抗炎藥，小劑量阿司匹林（＜325 mg/d，其中100 mg/d 是最為常用的劑量）被認(rèn)為是“關(guān)鍵和基礎(chǔ)”的抗血小板藥物，臨床上廣泛用于治療心絞痛、缺血性心臟病、心肺梗死、腦血栓等疾病。丹紅注射液（Danhong Injection，DHI）由丹參和紅花2味中藥組成，主要功效是活血化瘀、通脈舒絡(luò)，臨床廣泛用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦血栓等疾病。丹紅注射液和阿司匹林是治療心腦血管疾病的中西藥代表，臨床聯(lián)合用藥頻率很高。有學(xué)者基于醫(yī)院信息系統(tǒng)分析丹紅注射液的聯(lián)合用藥情況，發(fā)現(xiàn)與丹紅注射液聯(lián)合使用的最常用藥物就是阿司匹林，聯(lián)合使用頻次高達(dá)90%以上[3]。在丹紅注射液與阿司匹林高頻率聯(lián)合用藥的情況下，藥物相互作用對用藥安全性和有效性帶來的影響也將是廣泛的。

本課題組前期采用代謝組學(xué)結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析的方法發(fā)現(xiàn)阿司匹林與丹紅注射液之間存在藥物相互作用[4]；丹紅注射液可以通過促進(jìn)胃黏液分泌、降低胃蛋白酶活性以及降低活性氧簇水平來減輕阿司匹林引起的胃黏膜損傷[5]；丹紅注射液可以通過抑制有機陰離子轉(zhuǎn)運體的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)以及轉(zhuǎn)運功能來減少水楊酸的腎臟排泄[6]。本研究基于藥動學(xué)相互作用，進(jìn)一步探討阿司匹林與丹紅注射液的藥物相互作用特征，評價阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對丹紅注射液中主要丹酚酸類成分藥動學(xué)的影響，以及對阿司匹林主要代謝產(chǎn)物腎臟排泄的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，12 周齡，體質(zhì)量350～400 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心，環(huán)境溫度為18～29 ℃，相對濕度為40%～70%，采光條件為l2 h明/l2 h 暗，照度為150～300 lx。所有動物實驗均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的標(biāo)準(zhǔn)（批準(zhǔn)號201805A023）。

1.2 藥品、試劑與儀器

阿司匹林原料藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號27383）購自阿拉丁化學(xué)有限公司，每天給藥前用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL 的溶液。丹紅注射液（10 mL/支，批號15081038）由菏澤步長制藥有限公司提供。對照品水楊酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號BW2024）、丹酚酸 A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號PCS0265）、丹酚酸 B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號BW1690）、迷迭香酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號BW2065）、丹參素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號BW1693）、龍膽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號SH-1022）、O-羥基馬尿酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號SH-B25661）、氯霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號BW1830）以及鹽酸苯海拉明（質(zhì)量分?jǐn)?shù)C＞98%，批號BW2015）均購自中國食品藥品檢定研究院。

β-葡萄糖醛酸酶（批號 G0251）購自美國Sigma-Aldrich Co.LLC.。β-葡萄糖醛酸酶常用于水解酚基葡萄糖醛酸苷，1 個Sigma 單位的β-葡萄糖醛酸酶在適宜的孵育條件下（pH 5.0，37 ℃）每小時能從酚酞葡萄糖醛酸苷中水解出1.0 μg 的酚酞。血栓烷B2（thromboxane B2，TXB2，批號B001）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α，批號H204）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；ML204 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PV-1 迷你渦旋混勻器（英國格蘭特公司）；TS100 恒溫混勻儀（杭州瑞誠儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

將24 只大鼠隨機分為空白組、阿司匹林組、丹紅注射液組和阿司匹林-丹紅注射液聯(lián)合使用組，每組6 只。空白組大鼠每天規(guī)律給水喂食；阿司匹林組大鼠每天ig 阿司匹林溶液1 次（10.41 mg/kg），連續(xù)ig 14 d；丹紅注射液組大鼠每天尾iv 丹紅注射液1 次（4.16 mL/kg），連續(xù)注射14 d；聯(lián)合使用組大鼠每天尾iv 丹紅注射液（4.16 mL/kg）后立即ig阿司匹林溶液（10.41 mg/kg），連續(xù)給藥14 d。阿司匹林和丹紅注射液每天的給藥劑量相當(dāng)于體質(zhì)量60 kg 的患者每天服用100 mg 的阿司匹林或者滴注40 mL 的丹紅注射液[7]。大鼠尾iv 丹紅注射液的速度控制在1 mL/min。動物實驗共進(jìn)行3 個批次，其中1 個批次用于采集血漿樣品，測定血漿樣品中水楊酸及4 種丹酚酸的含量；第2 個批次用于收集尿液樣品，測定尿液樣品中5 種阿司匹林代謝產(chǎn)物的含量；第3 個批次用于采集血漿樣品，測定血漿樣品中TXB2和6-keto-PGF1α水平。

2.2 血漿樣品的采集與處理

第14 天給藥結(jié)束后將所有大鼠禁食12 h，第15 天各組大鼠按照規(guī)定的給藥方式分別進(jìn)行給藥，給藥后1、5、15、30、45 min 及1、1.5、2、4、6、9、12、24 h 分別從眼球后靜脈叢取血，每次的取血體積為0.3 mL，血液樣品置于裝有33 μL 枸櫞酸鈉溶液（3.8%）的離心管中。取血過程中每隔2 h ip一次生理鹽水，補充大鼠的循環(huán)血量[8]。

將血液樣品離心（15 000×g，10 min）后，取上清液，獲得血漿樣品。取100 μL 血漿樣品置于新的離心管中，加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和200 μL 甲醇溶液，充分渦旋30 s 后離心（15 000×g，10 min），取上清液用于UHPLC-MS/MS 分析。氯霉素和苯海拉明分別為ESI+和ESI-模式的內(nèi)標(biāo)，配制溶劑為甲醇，質(zhì)量濃度分別為1.66、0.71 μg/mL。選擇氯霉素和苯海拉明作為內(nèi)標(biāo)的原因有3 個：（1）在血漿樣品處理和色譜分析過程中氯霉素和苯海拉明非常穩(wěn)定；（2）氯霉素和苯海拉明的色譜保留時間與分析物接近；（3）氯霉素和苯海拉明的響應(yīng)不會對分析物的測定產(chǎn)生干擾。

2.3 UHPLC-MS/MS 同時測定血漿樣品中水楊酸及4 種丹酚酸的含量

應(yīng)用Acquity UHPLCTM系統(tǒng)（Waters Corp.，Milford，MA，USA）進(jìn)行色譜分析。使用的色譜柱為UHPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。柱溫和自動進(jìn)樣器的溫度分別控制在35、4 ℃。流動相：甲酸-水溶液（1∶1000，A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，3% B；1～6 min，3%～40% B；6～8 min，40%～95% B；8～9 min，95% B；9～9.2 min，95%～97% B。進(jìn)樣體積為5 μL。

應(yīng)用Xevo Triple Quadrupole Mass Spectrometer（Waters Corp.，Milford，MA，USA）進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測參數(shù)設(shè)置：毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度550 ℃，錐孔氣流速度50 L/h，脫溶劑氣流速度1000 L/h。水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素的最佳檢測條件見表1。

表1 水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、氯霉素和苯海拉明的UHPLC-MS/MS 分析最佳檢測條件Table 1 Optimal detection conditions for salicylic acid,salvianolic acid A,salvianolic acid B,rosmarinic acid,tanshinol,chlormycetin,and diphenhydramine by UHPLC-MS/MS analysis

配制含有水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸及丹參素的質(zhì)控樣品（高、中、低3 個濃度水平），根據(jù)美國食品藥品管理局（FDA）的生物分析方法驗證指南進(jìn)行方法學(xué)考察，方法學(xué)考察包括選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 尿液樣品的收集與處理

第14 天給藥結(jié)束后將大鼠放入代謝籠，收集24 h 的尿液樣品，并記錄尿液樣品的體積。整個尿液收集過程中尿液收集管都置于冰上。收集的尿液樣品立即離心（800×g、10 min），取上清液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 酶水解結(jié)合UHPLC-MS/MS 法測定尿液樣品中阿司匹林5 種代謝產(chǎn)物的含量

色譜及質(zhì)譜分析條件及方法學(xué)考察參考本課題組前期建立的方法[9]。

水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的對照品無法通過商業(yè)化途徑獲得，因此，無法通過儀器分析方法直接測定尿液樣品中的含量。但是，可以應(yīng)用本課題組前期建立的酶水解結(jié)合UHPLC-MS/MS 的分析方法，將水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷用β-葡萄糖醛酸酶水解，通過測定釋放的水楊酸和O-羥基馬尿酸的含量，來間接測定尿液樣品中水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的含量。具體方法如下：（1）建立水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的UHPLC-MS/MS 檢測方法。采用阿司匹林組的尿液樣品（該尿液樣品中含有水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷），根據(jù)水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的結(jié)構(gòu)式和相對分子質(zhì)量，對離子檢測模式、母離子、子離子、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷的最佳檢測條件：（ESI-）m/z313→m/z137，錐孔電壓20 kV，碰撞能量15 eV，保留時間1.68 min；O-羥基馬尿酸葡萄糖酚基醛酸苷的最佳檢測條件：（ESI+）m/z372→m/z196，錐孔電壓10 kV，碰撞能量10 eV，保留時間1.40 min。（2）優(yōu)化酶解時間以確保水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷完全水解。在β-葡萄糖醛酸酶濃度為10 kU/mL 以及溫度為37 ℃的反應(yīng)條件下，水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷經(jīng)過4 h 的酶解反應(yīng)可以完全水解為水楊酸，O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷經(jīng)過8 h 的酶解反應(yīng)可以完全水解為O-羥基馬尿酸。因此，將酶解時間設(shè)定為8 h 可以確保水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷均完全水解。（3）樣品分析與數(shù)據(jù)處理，從同一份尿液樣品中制備2 份完全相同的檢測樣本，一份直接用于UHPLC-MS/MS 分析，測定尿液樣品中水楊酸、龍膽酸和O-羥基馬尿酸的含量。另一份酶水解后用于UHPLC-MS/MS 分析，測定尿液樣品中水楊酸和O-羥基馬尿酸的總量，根據(jù)酶解反應(yīng)尿液樣品與非酶解反應(yīng)尿液樣品的分析結(jié)果，計算水楊酸和O-羥基馬尿酸增加的濃度，分別就是尿液樣品中水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的濃度[9]。

2.6 血漿樣品中TXB2和6-keto-PGF1α水平的測定

第14 天給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食24 h。第15天用10%水合氯醛溶液將所有大鼠麻醉（0.3 mL/100 g），進(jìn)行頸總動脈取血。血液樣品置于裝有枸櫞酸鈉溶液（3.8%）的離心管中，離心（15 000×g、10 min）后取上清液獲得血漿樣品。采用 TXB2和6-keto-PGF1α試劑盒測定血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平，具體操作過程參見試劑盒說明書。

2.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用±s（n=6）表示。采用DAS 2.0計算各分析物的藥動學(xué)參數(shù)。采用Nonparametric Mann-Whitney Test 分析組間差異性，P＜0.05 表示顯著性差異，P＜0.01 表示極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對彼此藥物代謝動力學(xué)的影響

基于UHPLC-MS/MS 建立的分析方法能快速分離并定量血漿樣品中的水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素?？瞻籽獫{樣品中的內(nèi)源性成分、內(nèi)標(biāo)成分不會對目標(biāo)成分的測定產(chǎn)生干擾，目標(biāo)成分之間也不會產(chǎn)生相互干擾（圖1）。水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素的準(zhǔn)確度（95.47%～102.68%）、精密度（3.66%～14.36%）、回收率（93.13%～108.21%）、基質(zhì)效應(yīng)（96.81%～102.49%）和穩(wěn)定性（91.92%～104.01%）均在限定范圍內(nèi)（表2）。在對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度水平，各成分均具有良好的儀器響應(yīng)（信噪比＞10，準(zhǔn)確度95.47%～103.33%，日內(nèi)精密度5.00%～11.19%，日間精密度6.58%～12.21%），因此，將各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度設(shè)定為各自的定量下限。水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量下限見表3。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示本方法能準(zhǔn)確、精密、穩(wěn)定、可靠地測定血漿樣品中水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素的含量。

圖1 水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、氯霉素和苯海拉明的UHPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of salicylic acid,salvianolic acid A,salvianolic acid B,rosmarinic acid,tanshinol,chlormycetin and diphenhydramine

表2 水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素UHPLC-MS/MS 分析的準(zhǔn)確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性Table 2 Accuracy,precision,recovery,matrix effect and stability of salicylic acid,salvianolic acid A,salvianolic acid B,rosmarinic acid,and tanshinol by UHPLC-MS/MS analysis

表3 水楊酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹參素UHPLC-MS/MS 分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 3 Calibration curve,correlation coefficient,linear range and limit of quantification of salicylic acid,salvianolic acid A,salvianolic acid B,rosmarinic acid,and tanshinol by UHPLC-MS/MS analysis

阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用主要影響阿司匹林的代謝動力學(xué)特征（圖2），對丹紅注射液中主要丹酚酸類成分的代謝動力學(xué)特征無顯著影響（圖3）。阿司匹林在吸收過程中及吸收入血后，會迅速被胃黏膜、血漿、紅細(xì)胞及肝中的酯酶水解為水楊酸。因此，阿司匹林的血藥濃度低，血漿半衰期為15～20 min[10]。與阿司匹林組相比，聯(lián)合使用組水楊酸藥-時曲線下面積（AUC0-24）以及最大血藥濃度（Cmax）均顯著增加（P＜0.05，圖2-B）。但是，與丹紅注射液組相比，聯(lián)合使用組丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸以及丹參素的藥-時曲線下面積以及最大血藥濃度均無顯著變化（圖3）。

圖2 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對阿司匹林水解產(chǎn)物水楊酸代謝動力學(xué)特征的影響(±s,n=6)Fig.2 Effect of drug-herb interaction of aspirin and Danhong Injection on pharmacokinetics characteristics of aspirin hydrolyzed salicylic acid(±s,n=6)

圖3 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對丹紅注射液中主要丹酚酸的代謝動力學(xué)特征的影響(±s,n=6)Fig.3 Effect of drug-herb interaction of aspirin and Danhong Injection on metabolic kinetic characteristics of main salvianolic acids in Danhong Injection(±s,n=6)

3.2 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對阿司匹林代謝產(chǎn)物腎臟排泄的影響

阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用顯著減少水楊酸的腎臟排泄量（P＜0.01，圖4-A），但對阿司匹林其他代謝產(chǎn)物（龍膽酸、O-羥基馬尿酸、水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷）的腎臟排泄無顯著影響（圖4-A）。與阿司匹林組相比，聯(lián)合使用組水楊酸、龍膽酸、O-羥基馬尿酸、水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷這5 種代謝產(chǎn)物的腎臟排泄總量無顯著變化[阿司匹林組（91.16±15.63）μmol，聯(lián)合使用組（89.70±20.82）μmol]。但是，除水楊酸以外的其他4 種代謝產(chǎn)物的腎臟排泄量均有增加的趨勢，將這4 種代謝產(chǎn)物的尿液排泄量作為整體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用會導(dǎo)致除水楊酸以外的其他4 種代謝產(chǎn)物的尿液排泄總量顯著增加[阿司匹林組（66.92±16.44）μmol，聯(lián)合使用組（86.65±5.76）μmol]，所占阿司匹林代謝產(chǎn)物腎臟排泄總量的比例也由73%增加到82%（圖4-B）。

圖4 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對阿司匹林代謝產(chǎn)物腎臟排泄的影響(±s,n=6)Fig.4 Effect of drug-herb interaction of aspirin and Danhong Injection on renal excretion of aspirin metabolites(±s,n=6)

3.3 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對阿司匹林抗血小板作用的影響

阿司匹林通過抑制血小板環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性，減少TXA2生成，發(fā)揮抑制血小板聚集的作用[11]。阿司匹林通過乙?；饔靡种艭OX 活性被認(rèn)為是阿司匹林發(fā)揮抗血小板作用的關(guān)鍵[12]。阿司匹林乙?；“錍OX 時存在2個獨立位點：一是結(jié)合位點（鐵離子-血紅素陽離子位點，F(xiàn)e2+-heme cationic site），阿司匹林首先快速可逆地與鐵離子-血紅素陽離子位點結(jié)合；阿司匹林與鐵離子-血紅素陽離子位點的結(jié)合過程可以被其他藥物競爭性拮抗，鄰羥基苯甲酸是藥物拮抗阿司匹林與COX 結(jié)合所需要的最小有效基團[13-14]。二是催化位點（絲氨酸殘基530 位點，serine residue 530），阿司匹林與鐵離子-血紅素陽離子位點結(jié)合后通過對臨近的絲氨酸殘基530 位點進(jìn)行緩慢不可逆的乙?；饔冒l(fā)揮對COX 的抑制作用。

水楊酸沒有乙?；鶊F，因此對COX 不具有乙酰化作用，但是水楊酸對陽離子結(jié)合位點的親和力與阿司匹林相當(dāng)，因此水楊酸對血小板COX 也具有微弱的抑制作用[15]：在全血中，阿司匹林抑制TXA2生成以及抑制血小板聚集的能力分別是水楊酸的74 倍和2136 倍[16]。此外，與鐵離子-血紅素陽離子位點的強親和力導(dǎo)致水楊酸與阿司匹林發(fā)生競爭性拮抗，阻止阿司匹林與鐵離子-血紅素陽離子位點結(jié)合，進(jìn)一步阻止阿司匹林對絲氨酸殘基530 位點的催化作用[12-15]。因此，阿司匹林是發(fā)揮抗血小板作用的有效成分，當(dāng)水解為水楊酸之后就幾乎失去了抗血小板作用，而且水楊酸還會濃度相關(guān)性地拮抗阿司匹林的抗血小板作用（圖5-A）[16]。水楊酸拮抗阿司匹林抗血小板作用伴隨著潛在的風(fēng)險信號，前期已經(jīng)有臨床研究證實，除阿司匹林外還服用雙氯芬酸、布洛芬以及吲哚美辛等其他非甾體抗炎藥的患者，發(fā)生心肌梗死等心血管疾病的風(fēng)險將增加2.8 倍[17-19]，因為這些非甾體抗炎藥均會拮抗阿司匹林的抗血小板作用。那么，阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用導(dǎo)致水楊酸血藥濃度增加，是否會影響阿司匹林的抗血小板作用應(yīng)進(jìn)一步探討。

圖5 阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用對阿司匹林抗血小板作用的影響(±s,n=6)Fig.5 Effect of drug-herb interaction of aspirin and Danhong Injection on antiplatelet effect of aspirin(±s,n=6)

實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，阿司匹林組和丹紅注射液組的血漿TXB2水平均顯著降低（P＜0.01，圖5-B），其中，丹紅注射液對血漿TXB2水平的抑制作用要略強于阿司匹林（阿司匹林組抑制率為35.5%，丹紅注射液組抑制率為36.3%）。阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)合使用組的血漿TXB2水平進(jìn)一步下降，與阿司匹林組相比下降了30.4%，與丹紅注射液組相比下降了29.5%（P＜0.01，圖5-B）。但是，無論是阿司匹林組、丹紅注射液組，還是聯(lián)合使用組，均對血漿6-keto-PGF1α水平無顯著影響（圖5-B）。因此，與阿司匹林組或丹紅注射液組相比，聯(lián)合使用組的血漿TXB2/6-keto-PGF1α水平顯著降低（P＜0.01，圖5-C），提示阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用并不會拮抗阿司匹林的抗血小板作用，反而增強了整體的抗血小板作用，具體作用機制還需進(jìn)一步實驗研究。

4 討論

阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用導(dǎo)致水楊酸血藥濃度顯著增加，但對丹紅注射液中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸以及丹參素等主要丹酚酸類成分的代謝動力學(xué)無顯著影響。因此，本實驗進(jìn)一步探討了阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用對阿司匹林水解產(chǎn)物水楊酸腎臟排泄的影響，發(fā)現(xiàn)阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用后會導(dǎo)致水楊酸的腎臟排泄量顯著減少。水楊酸是阿司匹林唯一的水解產(chǎn)物，除了以原型進(jìn)行腎臟排泄外，還會被代謝成龍膽酸、O-羥基馬尿酸、水楊酸?；咸烟侨┧彳?、水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷、O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷以及龍膽尿酸等[9]，這些I相和II相代謝產(chǎn)物均具有完整的腎臟排泄過程（圖6）。因此，本實驗進(jìn)一步探討了相互作用對龍膽酸、O-羥基馬尿酸、水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷以及O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷腎臟排泄的影響，發(fā)現(xiàn)阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用導(dǎo)致水楊酸腎臟排泄量減少，水楊酸血藥濃度增加，血液循環(huán)中增加的水楊酸則通過轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物進(jìn)行代償性排泄，導(dǎo)致龍膽酸、O-羥基馬尿酸、水楊酸酚基葡萄糖醛酸苷和O-羥基馬尿酸酚基葡萄糖醛酸苷的腎臟排泄總量顯著增加。

圖6 阿司匹林的體內(nèi)代謝過程示意圖[9]Fig.6 Metabolic pathway of aspirin in vivo[9]

阿司匹林是發(fā)揮抗血小板作用的有效成分，當(dāng)水解為水楊酸后就幾乎失去了抗血小板作用，而且水楊酸還會濃度相關(guān)性地拮抗阿司匹林的抗血小板作用[16]。因此，阿司匹林與丹紅注射液相互作用是否會影響阿司匹林的抗血小板作用值得進(jìn)一步探討。本實驗通過測定血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平初步評價了阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用對阿司匹林抗血小板作用的影響。前列腺素合酶是一個雙功能酶，同時具有環(huán)加氧酶活性和過氧酶活性。花生四烯酸在環(huán)加氧酶活性作用下轉(zhuǎn)化成前列腺素G2（prostaglandin G2，PGG2），PGG2在過氧酶作用下還原成前列腺素H2（PGH2），PGH2在血栓合酶作用下生成血栓素A2（thromboxane A2，TXA2），在前列環(huán)素合酶作用下生成前列環(huán)素I2（PGI2），TXA2具有誘導(dǎo)血小板聚集和縮血管作用，而PGI2具有抗血小板聚集和舒血管作用，血小板聚集和解聚過程受TXA2和PGI2調(diào)控。TXA2和PGI2是評價藥物抗血小板作用的黃金指標(biāo)，但是TXA2的生物半衰期只有 30 s，會迅速轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的 TXB2，6-keto-PGF1α是PGI2的水解產(chǎn)物，常用作標(biāo)記物來評價PGI2的生物合成。因此，本實驗通過測定TXB2和6-keto-PGF1α水平來評價阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用后整體的抗血小板作用。結(jié)果顯示，阿司匹林與丹紅注射液相互作用并沒有拮抗阿司匹林的抗血小板作用，反而增強了整體的抗血小板作用，具體的作用機制還需進(jìn)一步實驗探討。

本研究基于健康動物探討了阿司匹林與丹紅注射液相互作用的藥動學(xué)一般規(guī)律，初步發(fā)現(xiàn)了阿司匹林與丹紅注射液聯(lián)用對阿司匹林水解產(chǎn)物水楊酸藥動學(xué)的影響，后期將基于心血管疾病模型進(jìn)一步評價阿司匹林與丹紅注射液的相互作用特征，以期為阿司匹林與丹紅注射液臨床聯(lián)合用藥提供充實的實驗基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突