王婉先，姚 曼，余 欽，李一璇，凌昌全,*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433

3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 中醫(yī)腫瘤科，上海 200433

4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)醫(yī)院，上海 200437

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率日益升高，已成為最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病之一[1]。海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科研發(fā)的甘棗寧復(fù)方由大棗、山藥、山楂、佛手、荷葉、玉米須6 味中藥組成，具有疏肝、健脾、調(diào)脂的功效，對(duì)NAFLD 療效顯著[2-3]。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，甘棗寧治療NAFLD 具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，涉及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的激活、調(diào)控活性氧代謝等生物學(xué)過(guò)程。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)主要基于文獻(xiàn)報(bào)道，在藥材炮制過(guò)程中，其所含化學(xué)成分與原飲片可能存在差異[5]。因此，本研究以超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）鑒定數(shù)據(jù)為依據(jù)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并考察甘棗寧關(guān)鍵活性成分的抗炎作用，為系統(tǒng)分析甘棗寧治療NAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 飲片

大棗（批號(hào)200214-1）、山藥（批號(hào)200505-1）、山楂（批號(hào)200417-1）、佛手（批號(hào)200417-1）、荷葉（批號(hào)200320-1）購(gòu)自安國(guó)市同德中藥材有限公司，玉米須（批號(hào)570180701）購(gòu)自北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所楊小平副研究員鑒定分別為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)、薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖、薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實(shí)、蕓香科植物佛手Citrus medicaL.var.sarco-dactylisSwingle 的干燥果實(shí)、睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉、禾本科植物玉蜀黍Zea maysL.的干燥花柱和柱頭。

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品(S)-N-衡州烏藥堿、(R)-N-衡州烏藥堿、N-去甲基亞美罌粟堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素和N-去甲基荷葉堿為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；質(zhì)譜級(jí)乙腈（批號(hào)203500）和甲酸（批號(hào)202674）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)8120423）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)ST1276）、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)11020201014）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)1936917）、PBS 緩沖液（批號(hào)2026067）購(gòu)自以色列BI 公司；胎牛血清（批號(hào)ST180125）購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech 公司；LPS（批號(hào)L6529）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；小白菊內(nèi)酯（批號(hào)I1206051）購(gòu)自阿拉丁生化科技股份公司。

1.4 儀器

Acquity UPLC?I-Class 系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）；1290 Infinity II UPLC、6545 Q-TOF-MS/MS（美國(guó)Agilent 公司）；BWS-27 型精密恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；L550 型臺(tái)式離心機(jī)（上海盧湘儀有限公司）；311 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；EnSight 酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；HYC-290 型醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）。

2 方法

2.1 甘棗寧水煎液的制備

稱(chēng)取大棗飲片240 g、山藥飲片240 g、山楂飲片180 g、佛手飲片180 g、荷葉飲片120 g、玉米須飲片120 g，加入8 L 純水，浸泡30 min，100 ℃煎煮30 min，收集水煎液；加入8 L 純水，100 ℃煎煮20 min；合并2 次水煎液，過(guò)500 nm 陶瓷膜澄清，在進(jìn)膜壓0.33 MPa、出膜壓0.26 MPa 的條件下進(jìn)行澄清濾過(guò)，少量多次補(bǔ)水，收集透過(guò)液與截留液。將上述澄清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成相對(duì)密度為1.0～1.2 的浸膏，于真空干燥箱中干燥。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品(S)-N-衡州烏藥堿、(R)-N-衡州烏藥堿、N-去甲基亞美（杏黃）罌粟堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素、N-去甲基荷葉堿適量，溶于DMSO 分別配制成100 mmol/L 對(duì)照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析

2.3.1 色譜條件 BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，2%～90%B；體積流量為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 梯度洗脫程序優(yōu)化 在BEH Shield RP18色譜柱上調(diào)整梯度洗脫程序，優(yōu)化對(duì)甘棗寧水煎液的分離效果。梯度1：0～15 min，2%～90% B。梯度2：0～9 min，2%～40% B；9～10 min，40%～0% B。梯度3：0～2 min，0% B；2～10 min，0%～40% B；10～12 min，40%～90% B。梯度4：0～2 min，0%B；2～4 min，0%～10% B；4～13 min，10%～35%B；13～15 min，35%～90% B。

2.3.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子全掃描模式；干燥氣溫度為320 ℃；干燥氣體積流量為8 L/min；霧化氣壓力為35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣體積流量為11 L/min；毛細(xì)管電壓為＋3500 V 和-3000 V；碎裂電壓為135 V；碰撞電壓為65 V；碰撞能為20 eV；一級(jí)質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1300，二級(jí)質(zhì)量掃描范圍為m/z50 ～1000 ； 數(shù)據(jù)采集模式為Auto-MS/MS。

2.3.4 化學(xué)成分鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)甘棗寧水煎液進(jìn)行分析，比較甘棗寧水煎液在正負(fù)離子模式下的提取離子流圖，利用高分辨質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量信息，確認(rèn)化合物的分子式，隨后利用二級(jí)質(zhì)譜的碎片信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的裂解規(guī)律對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)，最后與文獻(xiàn)中的化合物碎片信息比對(duì)確認(rèn)。

2.4 甘棗寧提取液中活性成分及疾病靶點(diǎn)的篩選

采用TCMSP 平臺(tái)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[6]對(duì)甘棗寧水煎液鑒定出的化合物逐一進(jìn)行靶點(diǎn)檢索。以“NAFLD”作為關(guān)鍵詞，通過(guò)OMIM平臺(tái)（https://www.omim.org）、DisGeNET 平臺(tái)（https://www.disgenet.org/）[7]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）[8]檢索NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)。DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)納入系統(tǒng)評(píng)分＞0.01 的靶點(diǎn)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)納入系統(tǒng)評(píng)分＞45.475 的靶點(diǎn)，將各數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)合并去重，名稱(chēng)格式統(tǒng)一，獲得交集基因數(shù)據(jù)集。

2.5 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]對(duì)甘棗寧潛在靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，上傳交集基因數(shù)據(jù)集，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，采用Cytoscape 3.6.1 軟件[10]繪圖。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

采用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析[11]，將所得結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。采用Cytoscape 3.6.1 軟件ClueGo 插件[12]，錄入潛在靶點(diǎn)和疾病潛在相關(guān)靶點(diǎn)交集，進(jìn)行GO 分析，得出生物過(guò)程（biological process，BP），選擇物種為“Homo sapiens”，選擇合并相似功能，統(tǒng)計(jì)P＜0.05 的通路，GO 網(wǎng)絡(luò)連接評(píng)分選擇0.45，繪制關(guān)鍵BP 富集圖，將關(guān)鍵靶點(diǎn)與之聯(lián)系，并根據(jù)占比情況繪制餅狀圖。

2.7 甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO水平的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 RAW264.7 細(xì)胞，以2×104/孔接種至96 孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、小白菊內(nèi)酯（5 μmol/L）組、(S)-N-衡州烏藥堿（100 μmol/L）組、(R)-N-衡州烏藥堿（100 μmol/L）組、N-去甲基亞美罌粟堿（100 μmol/L）組、O-去甲基荷葉堿（100 μmol/L）組、(-)-表兒茶素（100 μmol/L）組、N-去甲基荷葉堿（100 μmol/L）組和甘棗寧水煎液（2.5 mg/mL）組。“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液分別用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度；“2.1”項(xiàng)下甘棗寧水煎液樣品用水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的儲(chǔ)存液，用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。各給藥組加入90 μL 相應(yīng)藥物，預(yù)處理1 h；模型組和各給藥組再加入10 μL LPS（1 μg/mL），對(duì)照組加入含DMSO 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO 水平。

2.8 甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

設(shè)置對(duì)照組、N-去甲基荷葉堿（200、100、50 μmol/L）組和甘棗寧水煎液（10.0、5.0、2.5 mg/mL）組。按“2.7”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，避光加入100 μL CCK8 溶液，培養(yǎng)1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A給藥/A對(duì)照

3 結(jié)果

3.1 甘棗寧水煎液中化學(xué)成分的鑒定

通過(guò)梯度條件的優(yōu)化，確定了最佳的流動(dòng)相條件為梯度4，在質(zhì)譜分析時(shí)為了確認(rèn)樣品在色譜柱上的殘留情況，增加了5 min 90% B 沖洗時(shí)間。甘棗寧水煎液的提取離子流圖見(jiàn)圖1，甘棗寧水煎液在正離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于負(fù)離子模式，正負(fù)離子模式下的離子化效率不同。通過(guò)對(duì)正負(fù)離子模式的成分解析，共獲得96 個(gè)主峰化合物，包括野漆樹(shù)苷、山柰素-3-O-己糖苷、金絲桃苷和香葉木素-7-O-葡萄糖苷等34 個(gè)黃酮類(lèi)化合物，以及氨基酸類(lèi)、單糖類(lèi)、酚酸類(lèi)、核苷類(lèi)、花青素類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)化合物。

圖1 甘棗寧水煎液在正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下的提取離子流圖Fig.1 Extraction ion chromatogram of Ganzaoning Decoction in positive ion mode(A)and negative ion mode(B)

3.2 甘棗寧治療NAFLD 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

續(xù)表1

預(yù)測(cè)出的31 個(gè)活性成分見(jiàn)表1。如圖2所示，甘棗寧治療NAFLD 共42 個(gè)靶點(diǎn)，“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。如圖4所示，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得出白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、趨化因子配體 2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等靶點(diǎn)相關(guān)性較強(qiáng)。

表1 甘棗寧活性成分Table 1 Active compounds of Ganzaoning

圖2 甘棗寧治療NAFLD 的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of Ganzaoning in treatment of NAFLD

圖3 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Traditional Chinese medicine-ingredient-target-pathway” network

圖4 甘棗寧治療NAFLD 的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of Ganzaoning in treatment of NAFLD

如圖5所示，甘棗寧治療NAFLD 主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及其糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路、血流剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、程序性壞死等通路。如圖6所示，甘棗寧治療NAFLD 涉及外源性凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)LPS反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)等20 個(gè)BP 條目，神經(jīng)元胞體、真空裂解、內(nèi)吞小泡等6 個(gè)細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目，核受體活性、蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性等10 個(gè)分子功能（molecular function，MF）條目。ClueGO 進(jìn)一步對(duì)BP 富集進(jìn)行分析見(jiàn)圖7，NOS3 處于核心位置，與細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)密切相關(guān)。

圖6 甘棗寧治療NAFLD 的GO 分析Fig.6 GO analysis of Ganzaoning in treatment of NAFLD

圖7 ClueGO BP 富集分析Fig.7 ClueGO biological process enrichment analysis

3.3 甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO水平的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，小白菊內(nèi)酯、(S)-N-衡州烏藥堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素、N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液組細(xì)胞上清液中NO 水平均顯著降低（P＜0.001），表明(S)-N-衡州烏藥堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素和N-去甲基荷葉堿是甘棗寧抗炎的重要藥效成分，其中N-去甲基荷葉堿抗炎活性最強(qiáng)。

圖8 甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的影響Fig.8 Effect of Ganzaoning Decoction on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

對(duì)N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液進(jìn)行抗炎活性劑量檢測(cè)，如圖9所示，從劑量效應(yīng)曲線計(jì)算獲得N-去甲基荷葉堿的IC50值為（105.41±12.08）μmol/L，甘棗寧水煎液的IC50值為（703.80±120.35）μg/mL。

圖9 不同劑量N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO 水平的影響Fig.9 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction with different concentrations on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

3.4 甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

如圖10所示，與對(duì)照組比較，N-去甲基荷葉堿（200、100 μmol/L）組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01、0.001），各劑量甘棗寧水煎液均無(wú)細(xì)胞毒性，表明甘棗寧具有較好的安全劑量范圍，符合藥食同源的特征。

圖10 N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響Fig.10 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction on survival rate of RAW264.7 cells

4 討論

中草藥調(diào)脂具有明顯優(yōu)勢(shì)[13]。甘棗寧能夠顯著改善NAFLD 患者血脂水平，經(jīng)甘棗寧顆粒干預(yù)后的脂肪肝患者的中醫(yī)證候積分明顯低于對(duì)照組，肝功能及血脂指標(biāo)改善顯著大于對(duì)照組[2-3]；甘棗寧顯著改善大鼠肝組織脂肪變性[14]。目前針對(duì)甘棗寧的相關(guān)成分鑒定與藥效基礎(chǔ)研究尚淺，本研究以UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析出甘棗寧所含468個(gè)化學(xué)成分，鑒定了96 個(gè)化學(xué)成分，較此前單純依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的84 個(gè)成分，更加豐富全面。金絲桃苷對(duì)抗化學(xué)損害、抗病毒、抑制自由基脂質(zhì)過(guò)氧化、保肝護(hù)肝等具有顯著作用[15-16]；異牡荊素可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)和氧化反應(yīng)來(lái)防御LPS/D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷[17]；荷葉生物堿類(lèi)化合物具有良好的抗炎[18]、調(diào)脂，抑制前脂肪細(xì)胞增殖的功能[19]，可以顯著抑制參與多種內(nèi)源物和外源物代謝的細(xì)胞色素P4502D6（cytochrome P4502D6，CYP2D6）酶[20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)甘棗寧治療NAFLD 的活性成分主要來(lái)自荷葉、山楂、佛手和大棗，結(jié)合PPI分析發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF、PPARG、CCL2、NOS3 等靶點(diǎn)相關(guān)性較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 形態(tài)學(xué)病變嚴(yán)重程度較高的III 類(lèi)肥胖患者在肝臟等白色脂肪組織中表現(xiàn)出較高的IL-6 和TNF-α 表達(dá)[21]。脂肪變性的原代肝細(xì)胞以脂肪形成的特征釋放促炎細(xì)胞因子IL-6[22]。NAFLD 中核因子的改變與脂肪變性、氧化應(yīng)激和炎性介質(zhì)（如TNF-α、IL-6）有關(guān)[23]。患有NAFLD 的病態(tài)肥胖患者血清中TNF-α 水平顯著升高[24]。PPARG 是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的核受體[25]。在NAFLD 發(fā)生期間，肝臟中CCL2 及其受體表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞蓄積，從而發(fā)生炎性反應(yīng)、纖維化和脂肪變性[26]。

KEGG 富集分析甘棗寧治療NAFLD 主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 通路、癌癥、乙型肝炎、血流剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、程序性壞死等通路。AGEs-RAGE 軸參與肝損傷和NAFLD 的發(fā)病機(jī)制[27]。RAGE 途徑能夠調(diào)節(jié)肝損傷、炎性反應(yīng)和纖維化[28]。NAFLD 是非鈣化斑塊的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[29]。GO 分析發(fā)現(xiàn)甘棗寧治療NAFLD 涉及外源性凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)LPS 反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)等BP 條目，神經(jīng)元胞體、真空裂解、內(nèi)吞小泡等CC 條目，核受體活性、蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性等MF 條目。NAFLD 的發(fā)生與LPS 水平升高有關(guān)，動(dòng)物長(zhǎng)期sc LPS 和高脂飲食可通過(guò)核因子-κB 抑制物激酶ε（nuclear factor-κB inhibitor kinase ε，IKKε）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)誘發(fā)NAFLD[30]。線粒體的改變是導(dǎo)致NAFLD 的關(guān)鍵因素，β 氧化水平降低，脂肪生成的增加，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞中的積累，隨后產(chǎn)生活性氧和肝細(xì)胞損傷，激活Kupffer 細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)肝臟炎性反應(yīng)和纖維化[31]。NAFLD 中核受體如PPAR、組成性雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）、孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）、肝X 受體（liver X receptor，LXR）和法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的失調(diào)可能影響肝臟中內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝[32]。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[33]結(jié)果，進(jìn)一步考察甘棗寧及6 種荷葉生物堿的抗炎活性。NO 是一種脂溶性氣體物質(zhì)，在肝臟中存在典型的合成通路，能夠調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌舒張功能，增加通透性，促使細(xì)菌內(nèi)毒素入侵，與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[34-35]。NO 由NOS 催化產(chǎn)生，在體內(nèi)表現(xiàn)為神經(jīng)型、誘導(dǎo)型和內(nèi)皮型，其中內(nèi)皮型NOS 能夠通過(guò)干預(yù)肝臟線粒體影響NAFLD 疾病進(jìn)程[36]。ClueGO 分析發(fā)現(xiàn)，NOS3 處于核心位置，與細(xì)胞對(duì)LPS 的反應(yīng)密切相關(guān)。NOS3 是小鼠高脂喂養(yǎng)期間肝胰島素抵抗和高胰島素血癥發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，同時(shí)也是影響NF-κB 活化的關(guān)鍵因子[37]，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，甘棗寧可能通過(guò)NOS3發(fā)揮治療NAFLD 的作用。

中醫(yī)藥治療肝臟疾病具有顯著療效[38]，在探索甘棗寧治療NAFLD 的作用機(jī)制過(guò)程中，面臨著中藥方劑多成分、多靶點(diǎn)的難點(diǎn)。本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS 與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確物質(zhì)基礎(chǔ)，再通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與臨床實(shí)踐互相印證，探討了甘棗寧治療NAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)研究需將證候、藥物配伍關(guān)系、量效等信息融入網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[39]，完善數(shù)據(jù)庫(kù)信息，衡量結(jié)果的可靠性，為今后進(jìn)一步挖掘方劑的有效性奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突