嚴(yán)琴英，文嬌麗，翁嘉綺，王煒瑋，方 敏，楊根生

浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014

石杉?jí)A甲［(5R,9R,11E)-5-氨基-11-亞乙基-5,8,9,10-四氫-7-甲基-5,9-亞甲基環(huán)辛四烯并[b]吡啶-2(1H)-酮，huperzine A］是于1986年從石杉科石杉屬植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.)Trevis.中分離得到的1 種新型石松類生物堿有效單體，是一種相對(duì)安全，且具有高度特異性、中樞活性和選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，能增強(qiáng)腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元功能，并且可以幫助阿爾茨海默病患者緩解癥狀。市面上已有石杉?jí)A甲膠囊[1]、石杉?jí)A甲片[2]、石杉?jí)A甲注射劑[3]等劑型。

阿爾茨海默病屬于一種進(jìn)行性慢性神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于65 歲及以上的老年人當(dāng)中[4]。隨著病程發(fā)展，阿爾茨海默病患者的學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行功能將持續(xù)下降[5]，但通過長(zhǎng)期藥物治療或可減慢病程發(fā)展。目前，石杉?jí)A甲片需每日按時(shí)服用2～3次，不得間斷，對(duì)執(zhí)行力已處較低狀態(tài)的患者，其依從性極低。而注射用石杉?jí)A甲往往需要專業(yè)醫(yī)療人員的介入，日常家用給藥可能性不高。本研究旨在開發(fā)一種新型、高效的石杉?jí)A甲經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)，作為解決注射給藥和口服給藥弊端的有效替代途徑，其使用便捷，既可幫助患者規(guī)避藥物在胃腸道內(nèi)消化代謝引起的副作用，還可以實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)可控釋放，并以無痛、無創(chuàng)、可自我給藥的方式顯著提高患者的依從性[6]。

微針經(jīng)皮給藥技術(shù)突破了傳統(tǒng)經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的應(yīng)用瓶頸，成為近幾年藥物遞送領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。微針是指直徑大小為微米級(jí)的針狀集合，長(zhǎng)度一般小于1 mm，主要通過短暫性破壞皮膚角質(zhì)層產(chǎn)生微孔道，并將所需治療量藥物經(jīng)微孔遞送至皮內(nèi)，既保持了傳統(tǒng)經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，又克服了傳統(tǒng)經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)滲透性不夠、遞送效率不高等問題[7]。微針尖端鋒利且針長(zhǎng)不足與真皮痛覺神經(jīng)廣泛接觸，從而達(dá)到既可刺穿角質(zhì)層又實(shí)現(xiàn)無痛給藥的目的[8-9]。目前研究最為廣泛的是可溶性微針或水凝膠微針[10]，即將藥物封裝在可溶解或可溶脹的聚合物基質(zhì)中，在插入皮膚時(shí)能夠完全溶解或充分溶脹以釋放所載藥物。

為保證可溶性微針及水凝膠微針刺入皮膚后的安全性，常用的基質(zhì)材料大多為各種可降解、生物相容性高的聚合物或糖，例如：硫酸軟骨素[11]、聚乳酸[12]、聚乙醇酸[13]、絲素蛋白[14]、羧甲基纖維素[15]、透明質(zhì)酸[16]、聚乙烯吡咯烷酮[17]、殼聚糖[18]、麥芽糖[19]、葡聚糖[20]、聚乙烯醇[21]、聚甲基乙烯基馬來酸酐共聚物[22]等。

由于單一材料所制成的微針往往存在機(jī)械強(qiáng)度低、穩(wěn)定性差等缺陷，所以一般載藥微針多選擇多種材料復(fù)合作為微針基質(zhì)。本研究選用聚乙烯醇和葡聚糖作為微針基質(zhì)材料，通過復(fù)合水凝膠薄膜的溶脹指標(biāo)確定了最佳混合比例，考察了不同濃度配比基質(zhì)材料的拉伸性能，用循環(huán)冷凍解凍法制作微針，對(duì)成功制備的微針進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度的評(píng)價(jià)和皮膚刺入性能的研究。采取兩步夾心法裝載干粉藥物，并研究其體外透皮釋放行為，以期為難溶性藥物石杉?jí)A甲經(jīng)皮遞送提供新的策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

P70F20L-DG 微波爐，廣東格蘭仕電器制造有限公司；Centra GP8R 離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；JJ-1 精密增力電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；HD-B 萬能材料試驗(yàn)機(jī)，杭州明凱科技有限公司；DS-5510DTH 超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司；RCT 磁力攪拌器，上海志威電器有限公司；TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海志威電器有限公司；BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)混合儀，其林貝爾儀器制造有限公司；MDQ-105M 數(shù)字千分尺，日本Mitutoyo 公司；Ultimate 3000 高效液相色譜儀，德國(guó)戴安公司；B-491 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；DZG-6050 真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA1604S 型分析天平，上海天平儀器廠；S-4700（II）型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi 公司；RYJ-12B 藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；TA.XT plus 物性測(cè)試儀，英國(guó)SMS 公司；RM2245 石蠟切片機(jī)，Leica公司；光學(xué)相干斷層掃描儀（optical coherence tomography，OCT），浙江工業(yè)大學(xué)信息與工程學(xué)院自制。

1.2 藥品與試劑

聚乙烯醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20080327；葡聚糖，阿拉丁試劑上海有限公司，批號(hào)J1617016；磷酸二氫鉀，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司；乙腈，F(xiàn)isher Scientific，批號(hào)102489；甲醇，Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)WXBC4003V；石杉?jí)A甲對(duì)照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)Q04Y160201；臺(tái)盼藍(lán)，碧云天試劑有限公司，批號(hào)ST798；多聚甲醛，武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)180320；甲醇，色譜純，Sigma-Aldrich 公司；水為雙蒸水，自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g。由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，合格證號(hào)：No.1704100008。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循浙江工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 聚乙烯醇復(fù)合水凝膠制備

稱取一定量的聚乙烯醇于圓底燒瓶中，加適量雙蒸水，在機(jī)械攪拌下水浴加熱至90 ℃，持續(xù)加熱3 h，至聚乙烯醇完全溶解，制得的聚乙烯醇溶液冷卻至室溫備用。再稱取一定量的葡聚糖粉末，加適量雙蒸水，室溫下攪拌至溶解備用。將聚乙烯醇溶液與葡聚糖溶液按不同比例，于室溫條件下充分混合，得到多種比例的混合凝膠基質(zhì)。將基質(zhì)放入自制模具中，-40 ℃冷凍1 h 后取出，微波解凍30 s，重復(fù)冷凍解凍多次。室溫下自然干燥24 h 后置于真空干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量。

2.2 聚乙烯醇復(fù)合水凝膠溶脹性能考察

將聚乙烯醇-葡聚糖復(fù)合水凝膠置于真空干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，準(zhǔn)確稱量并記錄聚乙烯醇-葡聚糖復(fù)合水凝膠的初始質(zhì)量。將其放入裝有足量雙蒸水的燒杯中進(jìn)行溶脹實(shí)驗(yàn)，每隔一段時(shí)間取出復(fù)合水凝膠，擦干表面水分，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量并記錄，直至復(fù)合水凝膠質(zhì)量不再增加，按以下公式計(jì)算溶脹比。繪制溶脹曲線，分別考察不同質(zhì)量比的聚乙烯醇-葡聚糖和冷凍解凍次數(shù)對(duì)復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響。

溶脹比＝(Ws－Wd)/Wd

Ws為溶脹后的復(fù)合水凝膠質(zhì)量[23]，Wd為上一時(shí)刻的復(fù)合水凝膠質(zhì)量

高分子聚合物材料在應(yīng)用于藥物遞送時(shí)，溶脹能力是一項(xiàng)重要指標(biāo)[24]。復(fù)合水凝膠作為微針基質(zhì)材料，在吸收皮膚間質(zhì)液后會(huì)明顯溶脹，高的溶脹率往往表現(xiàn)出更好的藥物釋放效果[25]。因此，本研究中，對(duì)不同條件下復(fù)合水凝膠的溶脹性能分別進(jìn)行了考察。通過分析復(fù)合水凝膠的溶脹曲線（圖1）發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍解凍循環(huán)次數(shù)的增加，復(fù)合水凝膠的溶脹率均有所下降，可能是由于多次循環(huán)后，復(fù)合水凝膠形成的物理交聯(lián)結(jié)晶密度增大所致；不同聚乙烯醇-葡聚糖質(zhì)量比中，9∶1 溶脹率明顯較好。此外，當(dāng)冷凍解凍循環(huán)次數(shù)為1 次時(shí)，復(fù)合水凝膠氣泡較多難以去除，對(duì)微針形態(tài)及其機(jī)械性能有嚴(yán)重的影響，而冷凍解凍次數(shù)為3 次和5 次時(shí)均未出現(xiàn)氣泡問題。綜合考慮溶脹率、氣泡等因素，確定冷凍解凍循環(huán)3 次、聚乙烯醇-葡聚糖質(zhì)量比9∶1為最優(yōu)條件。

圖1 不同冷凍解凍循環(huán)次數(shù)(A)和聚乙烯醇-葡聚糖不同質(zhì)量比下(B)的聚乙烯醇復(fù)合水凝膠的溶脹曲線(n=3)Fig.1 Swelling curve of polyvinyl alcohol composite hydrogel of different freezing and thawing cycles(A)and different ratios of PVA/dextran(B)(n=3)

2.3 聚乙烯醇復(fù)合水凝膠拉伸性能考察

考察不同質(zhì)量濃度（聚乙烯醇＋葡聚糖的總質(zhì)量濃度）微針基質(zhì)材料下聚乙烯醇-葡聚糖復(fù)合水凝膠的拉伸性能。復(fù)合水凝膠薄膜的厚度由數(shù)字千分尺測(cè)得，薄膜平均厚度為（0.33±0.06）mm。采用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試其力學(xué)性質(zhì)，設(shè)定測(cè)試材料的應(yīng)變速率為100 mm/min，拉伸樣品的尺寸大小均符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)拉伸工件要求，測(cè)定其斷裂伸長(zhǎng)率、拉伸強(qiáng)度[26]。表1 顯示了3 種不同質(zhì)量濃度的微針基質(zhì)材料復(fù)合水凝膠的斷裂伸長(zhǎng)率和拉伸強(qiáng)度。隨著微針基質(zhì)材料質(zhì)量濃度的提高，復(fù)合水凝膠的斷裂伸長(zhǎng)率和拉伸強(qiáng)度都呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，其中0.15 g/mL 聚乙烯醇-葡聚糖復(fù)合水凝膠拉伸強(qiáng)度最大。結(jié)合拉伸試驗(yàn)結(jié)果，分別選取0.08、0.15、0.20 g/mL 3 種質(zhì)量濃度微針基質(zhì)材料以“2.4”項(xiàng)所述制備工藝制作微針，發(fā)現(xiàn)0.20 g/mL 高質(zhì)量濃度組材料流動(dòng)性較差，微針制作離心困難且成型性差；0.15 g/mL 中質(zhì)量濃度組制作的微針硬度較強(qiáng)，但與皮膚的貼合性差，適合作為針尖材料；0.08 g/mL 低質(zhì)量濃度組制作的貼片表面較為平整且與皮膚的貼合性較好，適合作為背襯材料。

表1 不同質(zhì)量濃度微針基質(zhì)材料復(fù)合水凝膠對(duì)拉伸性能的影響(,n=3)Table 1 Effect of different concentrations of composite hydrogel on tensile properties(,n=3)

表1 不同質(zhì)量濃度微針基質(zhì)材料復(fù)合水凝膠對(duì)拉伸性能的影響(,n=3)Table 1 Effect of different concentrations of composite hydrogel on tensile properties(,n=3)

微針基質(zhì)材料/(g·mL-1)斷裂伸長(zhǎng)率/% 拉伸強(qiáng)度/MPa 0.08 30.24±2.78 29.08±2.22 0.15 50.42±2.25 37.55±4.00 0.20 27.08±3.15 19.35±1.24

2.4 石杉?jí)A甲復(fù)合水凝膠微針的制備

選用聚乙烯醇-葡聚糖質(zhì)量比為9∶1，按照背襯貼片最佳質(zhì)量濃度0.08 g/mL，針尖材料最佳質(zhì)量濃度0.15 g/mL，反復(fù)凍融次數(shù)3 次作為最優(yōu)條件制作微針。

2.4.1 微針陰模的制備 采用倒模法制備微針的陰模，陰模材料為聚二甲基硅氧烷（PDMS）。將PDMS與固化劑充分混合均勻，置入6 孔板中并通過真空干燥除去混合時(shí)產(chǎn)生的氣泡；隨后，將金屬微針陽(yáng)模固定于平板容器的中心位置，控制金屬微針的浸入深度；將其放入60 ℃干燥箱中干燥8 h，使PDMS材料充分凝固；最后剝離金屬微針，得到微針陰模。

2.4.2 微針針尖的制備 將0.15 g/mL 復(fù)合水凝膠基質(zhì)溶液倒入微針模具中，將裝有水凝膠基質(zhì)溶液的模具放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為3500 r/min，水平離心5 min 后旋轉(zhuǎn)180°繼續(xù)離心5 min，重復(fù)操作3次，去除氣泡，并使0.15 g/mL 復(fù)合水凝膠基質(zhì)進(jìn)入微針模具后保持底部平整。離心結(jié)束，取出模具，用藥匙刮去多余材料，后置于-40 ℃冰箱中冷凍1 h，取出模具，中火微波30 s 解凍，制得針頭。

2.4.3 載藥微針貼片的制備 將解凍完成的微針針頭模具置于水平桌面上，精確稱量2 mg 石杉?jí)A甲干粉，加入微針模具中，用藥匙壓平，再加入0.08 g/mL復(fù)合水凝膠基質(zhì)溶液，以3500 r/min離心5 min后旋轉(zhuǎn)180°繼續(xù)離心，重復(fù)操作至水凝膠完全水平形成背襯層。將模具置于-40 ℃冰柜內(nèi)冷凍1 h，取出模具，中火微波30 s 解凍，重復(fù)凍融3 次后經(jīng)室溫干燥24 h。用尖頭鑷子小心取出微針，在SEM下觀察，所制備的微針呈圓錐狀、形態(tài)良好、針尖銳利（圖2）。

圖2 石杉?jí)A甲復(fù)合水凝膠微針的SEM 圖Fig.2 SEM image of huperzine A composite hydrogel microneedles

2.5 石杉?jí)A甲微針力學(xué)性能考察

采用物性測(cè)試儀的壓縮模式研究了石杉?jí)A甲微針的力學(xué)性能，用膠帶將微針固定在分析儀的鋁制底座上，選用p/6 探針，壓縮速度設(shè)置為0.1 mm/s，觸發(fā)力設(shè)置為0.049 N，數(shù)據(jù)采集率設(shè)置為25。將微針剪成2×2 陣列，保持微針與探針軸向平行，以設(shè)定的條件進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)，得到力-位移曲線。

由圖3 的力-位移曲線可看出，在壓縮過程中，隨著壓縮位移的增加，微針承受的力也在同步增加，且載藥微針?biāo)惺艿牧κ冀K大于空白微針。這可能是因?yàn)樗幬镞M(jìn)入水凝膠中，填補(bǔ)了水凝膠薄膜的空隙，使水凝膠薄膜更加致密，從而使載藥微針可承受更大的壓力。當(dāng)壓縮距離達(dá)到0.5 mm 時(shí)，微針?biāo)惺艿膲毫_(dá)到最大且均未斷裂，其中空白微針為0.63 N/針，載藥微針為0.76 N/針，均具備刺入皮膚所需的機(jī)械強(qiáng)度（針尖直徑為24 μm 的微針成功穿透皮膚，約需要0.15 N/針的力[27]）。

圖3 聚乙烯醇-葡聚糖微針的力學(xué)評(píng)價(jià)Fig.3 Mechanical evaluation of polyvinyl alcohol-dextran microneedles

2.6 皮膚穿刺性能考察

2.6.1 離體皮膚實(shí)驗(yàn) 將健康SD 大鼠脫頸椎處死并脫毛，進(jìn)行皮膚剝離，用脫脂棉擦去皮下脂肪后，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，將皮膚保存在生理鹽水中備用。使用前擦干水分，角質(zhì)層側(cè)朝上放置并固定在泡沫板上，用自制的500 μm 微針貼片對(duì)皮膚進(jìn)行垂直按壓給藥，微針在皮膚上停留30 s 后移除，拍照記錄穿刺后皮膚針孔陣列，用1%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)穿刺后皮膚樣本進(jìn)行染色，并用PBS 洗去浮色，拍照記錄。

2.6.2 活體皮膚實(shí)驗(yàn) BALB/c 小鼠用水合氯醛麻醉，麻醉劑量為300～400 mg/kg，背腹部去毛擦干后，將微針裝于實(shí)驗(yàn)室自制給藥裝置上進(jìn)行皮膚垂直按壓，微針在皮膚上停留30 s，移去微針后立即剝離微針穿刺后的皮膚，用4%多聚甲醛固定24 h，取出后用不同梯度的酒精作脫水劑，脫去皮膚中的水分，再將皮膚置于二甲苯中使其透明。之后將皮膚放置于熔化的石蠟，保溫。包埋后將蠟塊固定于切片機(jī)上，切成微米級(jí)的薄片。最后將皮膚切片用蘇木精-伊紅染色（HE 染色），制備HE 染色切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝。

由圖4-A 可見，經(jīng)微針處理后的皮膚表面針孔陣列整齊清晰，與刺入貼片一致。采用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)刺入后的皮膚進(jìn)行染色，以驗(yàn)證微針可成功刺入皮膚。這是因?yàn)檎；罴?xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，染料不能進(jìn)入胞內(nèi)，可被水或者有機(jī)洗劑完全清除；而微針刺入皮內(nèi)造成了皮膚細(xì)胞的死亡，細(xì)胞不再完整，胞膜的通透性增加，可被染成藍(lán)色，且染料與死細(xì)胞結(jié)合后不能被完全清洗。圖4-B 表明微針刺破了皮膚，并在皮膚表面形成了針孔陣列；圖4-C 組織學(xué)染色切片顯示，針頭成功穿透角質(zhì)層進(jìn)入皮內(nèi)。綜上，復(fù)合水凝膠微針可穿透小鼠表皮，為藥物有效遞送至皮內(nèi)提供基礎(chǔ)。

圖4 微針刺入皮膚性能考察Fig.4 Skin penetration test of microneedles

2.7 光學(xué)相干斷層掃描儀測(cè)定皮膚刺入深度

為了進(jìn)一步考察微針在皮內(nèi)的刺入深度，將水凝膠微針刺入離體大鼠皮膚中，用自行改裝的OCT對(duì)皮膚層進(jìn)行2D 橫截面掃描。所獲得圖像文件的比例尺為縱向1.0 像素＝8.8 μm，橫向1.0 像素＝10μm[28]，使用成像軟件Image J 可以精確計(jì)算微針的穿透深度。

由圖5 對(duì)比清晰可見，微針已成功刺入皮膚。通過成像軟件Image J 計(jì)算出刺入皮膚的深度大約是500 μm。本研究使用的光學(xué)相干斷層成像技術(shù)可直觀地判斷微針是否能夠刺入皮膚以及刺入皮膚的深度，是一種富有前景的無創(chuàng)成像技術(shù)，為微針刺入皮膚行為的表征提供了一種快速便捷的手段。

圖5 石杉?jí)A甲復(fù)合水凝膠微針的OCT 圖像Fig.5 OCT images of huperzine A composite hydrogel microneedle

2.8 微針刺入皮膚后的愈合評(píng)價(jià)

為評(píng)價(jià)微針給藥后穿刺部位的皮膚愈合情況，將小鼠用50 g/L 水合氯醛麻醉后用剃毛機(jī)脫毛，將微針貼于小鼠背部持續(xù)2 min 后，用相機(jī)記錄皮膚愈合整個(gè)過程。結(jié)果如圖6所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)微針在皮膚中形成的孔逐漸消失，5 min 左右針孔已經(jīng)消失不見，而且微針刺入后并沒有紅腫和炎癥現(xiàn)象發(fā)生，說明本實(shí)驗(yàn)制備的可溶性微針生物相容性較好，微小創(chuàng)傷能夠盡快恢復(fù)。

圖6 微針刺入皮膚愈合情況Fig.6 Image of skin would healing process after microneedles puncture

2.9 石杉?jí)A甲體外定量HPLC 分析方法

2.9.1 色譜條件 C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-1.0 mol/L 磷酸緩沖液（86∶14）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)307 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.9.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取石杉?jí)A甲對(duì)照品2.00 mg，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100.0 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，既得對(duì)照品儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL）。

2.9.3 專屬性考察 對(duì)比空白皮膚透析液和石杉?jí)A甲對(duì)照品的典型HPLC 圖，考察方法的專屬性。由圖7 可見，空白接收液對(duì)石杉?jí)A甲的色譜峰沒有干擾，方法的專屬性良好。

圖7 空白皮膚透析液(a)、石杉?jí)A甲對(duì)照品(b)和石杉?jí)A甲微針皮膚透析液(c)定量測(cè)定HPLC 圖Fig.7 Representative chromatograms of HPLC quantitative determination for blank skin dialysate(a),huperzine A reference(b)and huperzine A microneedles skin dialysate(c)

2.9.4 線性關(guān)系考察 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的石杉?jí)A甲2.00 mg 置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，搖勻。精密吸取10.0、7.5、5.0、2.5、1.0、0.5 mL 置于10.0 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以石杉?jí)A甲峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝0.739 7X＋0.513，r＝0.999 9，線性范圍1.00～20.00 μg/mL。

2.9.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取石杉?jí)A甲對(duì)照品溶液20 μL，照上述色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定其峰面積，RSD 為1.99%。

2.9.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取含藥基質(zhì)6 份，加入0.01 mol/L 鹽酸10 mL，渦旋2 min，再以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液稀釋后作回收率測(cè)定，結(jié)果平均加樣回收率為99.43%，RSD 為1.47%。

2.9.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取石杉?jí)A甲微針貼片6 片，將其溶解配制成質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL 的供試品溶液，過0.22 μm 濾膜，按照“2.9.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，石杉?jí)A甲質(zhì)量濃度為（9.318±1.460）μg/mL，RSD 為1.93%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.9.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取石杉?jí)A甲供試品溶液，于0、4、8、12、24 h 取樣，按上述方法測(cè)定石杉?jí)A甲峰面積，結(jié)果測(cè)定顯示，5 個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的RSD 為0.2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 石杉?jí)A甲微針體外透皮研究

采用改良的Franz 擴(kuò)散池，用離體大鼠皮膚進(jìn)行體外透皮作用的研究。對(duì)健康大鼠麻醉后脫毛并立即處死，采集背部皮膚樣本，除去皮下脂肪后，用手術(shù)剪修剪成合適大小，固定在擴(kuò)散池上。微針采用“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行穿刺，同時(shí)設(shè)置石杉?jí)A甲溶液組作為對(duì)照，蓋上擴(kuò)散池池蓋，用注射器往接收室中注入生理鹽水6.5 mL。在使用前進(jìn)行脫氣，設(shè)定溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。分別于透皮0、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72 h 后抽取全部的接收室液體，并補(bǔ)充相應(yīng)的生理鹽水。抽取的液體先經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，后取20 μL 進(jìn)入高效液相色譜儀檢測(cè)。

微針在皮膚中能吸收組織間液發(fā)生溶脹，并因此打開擴(kuò)散通道以釋放藥物[29]。由圖8 可見，在0～4 h 時(shí)，釋放較為緩慢；在4～12 h 時(shí)，釋放速率顯著提高；在12～36 h 時(shí)，釋放速率急劇上升。分析原因可能是一開始處于干燥狀態(tài)的水凝膠微針在刺破角質(zhì)層后在皮膚上形成微孔道，在0～4 h 時(shí)，聚乙烯醇處于玻璃態(tài)；隨著水凝膠逐漸接觸皮膚間質(zhì)液后發(fā)生溶脹并釋放藥物，藥物的釋放速率快速提高，在72 h 時(shí)的累積釋放率為（173.71±0.27）μg/(cm2·h)，藥物透皮率達(dá)到85.31%。而石杉?jí)A甲溶液組在72 h 時(shí)的藥物透皮率僅為5%，與石杉?jí)A甲微針組對(duì)比可知，石杉?jí)A甲微針貼片可顯著提高藥物的透皮效果。

圖8 石杉?jí)A甲微針累積釋放曲線(n=3)Fig.8 In vitro cumulative release of huperzine A microneedles(n=3)

3 討論

本研究旨在采用物理交聯(lián)法制備由聚乙烯醇和葡聚糖構(gòu)成的復(fù)合水凝膠微針，開發(fā)一種新型的經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)來改善難溶性藥物石杉?jí)A甲的遞送路徑和效率，從而提高患者依從性、實(shí)現(xiàn)經(jīng)皮緩釋之目的。本研究選用韌性較好的聚乙烯醇和脆性較好的葡聚糖2 種高分子材料，以反復(fù)冷凍-解凍法制備復(fù)合水凝膠，并考察了不同比例的聚乙烯醇和葡聚糖對(duì)水凝膠溶脹性能的影響。結(jié)果顯示，聚乙烯醇-葡聚糖配比為9∶1 時(shí)，溶脹率明顯較好；綜合考察水凝膠的溶脹性能及性狀，確定冷凍解凍循環(huán)3 次作為最優(yōu)工藝條件。考察微針基質(zhì)材料不同質(zhì)量濃度下復(fù)合水凝膠的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率以及制備成微針的可行性，確定背襯層最佳用量為0.08 g/mL聚乙烯醇-葡聚糖（9∶1），針尖材料最佳用量為0.15 g/mL 聚乙烯醇-葡聚糖（9∶1）。

本研究所制微針形狀較好，且具備合適的機(jī)械強(qiáng)度，皮膚實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此微針能成功刺入皮膚，透皮實(shí)驗(yàn)顯示了72 h 內(nèi)藥物累積釋放量大于85%。此外，本研究還采用無創(chuàng)簡(jiǎn)便的光學(xué)相干斷層成像技術(shù)，將微針插入皮膚的過程實(shí)時(shí)記錄下來，精確計(jì)算其刺入皮膚的深度，提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、可視化的新型測(cè)定手段。

綜上所述，水凝膠微針制備簡(jiǎn)便、使用方便、前景光明，為難溶性藥物石杉?jí)A甲實(shí)現(xiàn)高效、無痛、緩釋遞送提供了一種新的策略。除此之外，藥物通過微針進(jìn)入皮內(nèi)的擴(kuò)散、吸收及代謝過程的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突