李曉雪，趙 明,2*，馬耀玲，王 丹,2，時志春,2，李 軍,2，王金蘭,2，王偉明，張樹軍,2

1.齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

2.黑龍江省工業(yè)大麻加工技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006

3.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036

玉米須為禾本科玉蜀屬植物玉米Zea maysLinn.的花柱和柱頭，又名玉麥須、玉蜀黍芯、棒子毛，其味淡，性甘、平?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗氧化、抗腎結(jié)石、降血糖、清血熱、利尿、平肝、利膽等功效[1-6]。近年來，隨著生活水平的提高，人們越發(fā)注重醫(yī)療保健，更青睞天然綠色的傳統(tǒng)中藥材。玉米須不僅是傳統(tǒng)中藥材，還可做茶飲，具有利水、消腫、清熱、降血糖、降血壓等作用，其潛在的醫(yī)療保健作用與其生物活性成分密切相關(guān)[7-9]。為進一步開發(fā)利用玉米須資源，在前期研究[10]的基礎(chǔ)上，從玉米須甲醇浸提液醋酸乙酯萃取物中分離得到4 個化合物，通過理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合計算電子圓二色譜（ECD）鑒定其結(jié)構(gòu)分別為 6β,12β-二羥基-4(5),7(8)-玉米二烯[6β,12β-dihydroxy-4(5),7(8)-stigmdiene，1]、8α,10α-二羥基-4(5),7(12)-玉米二烯[8α,10α-dihydroxy-4(5),7(12)-stigmdiene，2]、環(huán)己甲酸甲酯（methyl cyclohexane-carboxylate，3）、氮乙酰對羥基苯乙胺（N-acethyl-tyramine，4）。其中化合物1、2 是未見報道的新化合物。評估了化合物1、2 對人膀胱癌T-24 細胞、卵巢癌SK-OV-3 細胞、宮頸癌HeLa 細胞、乳腺癌MCF-7 細胞、胃癌BGC-823 細胞的細胞毒活性及HepG2 細胞中葡萄糖消耗活性。化合物1 對SK-OV-3 細胞及T-24 細胞顯示出抑制活性，抑制率分別為11.86%、18.64%?；衔? 對HepG2細胞中葡萄糖消耗具有促進作用，消耗率為10.30%。

1 儀器與材料

X-6 顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；Autopol V 型旋光儀（美國魯?shù)婪蚬荆籜evo QTOF 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Bruker AV-600 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Shimadzu 高效液相色譜儀（日本島津公司）：LC-20AR 泵、RID-20A 視差折光檢測器、Sunfire TM Prep C18 OBDTM（100 mm×19 mm，5 μm）不銹鋼柱；柱色譜用硅膠（200～300 目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品；薄層色譜（TLC）硅膠板為煙臺化工廠產(chǎn)品；J-1500 CD 圓二色譜儀（日本分光株式會社）。

玉米須于2017年8月14日采自黑龍江省海倫市紅光農(nóng)場，經(jīng)齊齊哈爾大學(xué)沙偉教授鑒定為玉米Zea maysLinn.的花柱和柱頭，標本（No.20170814）收藏于齊齊哈爾大學(xué)天然產(chǎn)物研究室。

2 方法

2.1 提取與分離

11.0 kg 干燥的玉米須粉碎，每次用甲醇10 L室溫浸泡3 d 后濾過，重復(fù)3 次，合并浸提液濃縮至小體積加水混懸，依次用正己烷、醋酸乙酯萃取3 次，合并相同溶劑萃取液，減壓濃縮至恒定質(zhì)量，得醋酸乙酯萃取物11.7 g。

取醋酸乙酯萃取物11.2 g，經(jīng)硅膠色譜柱分離，依次用二氯甲烷-甲醇（9.5∶0.5，5.7 L）（8∶2，5.8 L）及甲醇（4.0 L）洗脫，經(jīng)TLC 檢測合并相近流分，濃縮得F1～F10。F4（738.7 mg）在流動相為甲醇-水（9∶1）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，得到F4-1～F4-5；F4-1（481.7 mg）在流動相為甲醇-水（7∶3）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，得到F4-1-1～F4-1-5；F4-1-1（163.2 mg）在流動相為甲醇-水（4∶6）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，得到化合物1（2.0 mg，tR＝20.9 min)、3（1.4 mg，tR＝10.2 min)。F5（1.7 g）在流動相為甲醇-水（9∶1）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，得到F5-1～F5-6；F5-1（508.2 mg）在流動相為甲醇-水（7∶3，體積流量4 mL/min）條件下進行反相HPLC 分離，得到F5-1-1～F5-1-9；F5-1-9（20.2 mg）在流動相為甲醇-水（6∶4）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，得到化合物4（1.5 mg，tR＝13.5 min）。F7（1.6 g）在流動相為甲醇-乙腈-水（2.8∶1.7∶5.5）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，分離得到F7-1～F7-6；F7-3（178.7 mg）在流動相為甲醇-乙腈-水（2.4∶1.6∶6.0）、體積流量4 mL/min 條件下進行反相HPLC 分離，分離得到化合物2（2.3 mg，tR＝41.2 min）。

2.2 腫瘤細胞抑制活性測定

以阿霉素（10 μmol/L）為陽性對照采用MTT法，評價化合物1、2 對人體腫瘤細胞株T-24、SK-OV-3、HeLa、MCF-7、BGC-823 的體外活性。用含10%胎牛血清培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔3×103～7×103個細胞接種到96 孔板，每孔體積100 μL，貼壁細胞提前24 h 接種培養(yǎng)。加入不同濃度（1、10、100 μmol/L）的待測化合物，48 h 后，向每孔中加入20 μL（5 mg/mL）MTT 溶液，并在37 ℃下孵育4 h。除去上清液后，向每孔中加入150 μL DMSO，用連續(xù)波長酶標儀在570 nm 處測定吸光度（A）值。按公式計算各樣品的腫瘤細胞生長抑制率。

抑制率＝(A對照－A樣品)/A對照

2.3 葡萄糖消耗活性測定

以二甲雙胍（1 μmol/L）為陽性對照，評價化合物1、2 對人肝癌HepG2 細胞的體外葡萄糖消耗活性。將HepG2 細胞在補充有10% FBS 的高葡萄糖DMEM 中的96 孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h，然后在無血清和無酚紅的高葡萄糖DMEM 中用0.15 mmol/L棕櫚酸酯處理12 h 后，將細胞分別用高葡萄糖DMEM 和PBS 洗滌2 次，將無血清和無酚紅的高葡萄糖DMEM 以及各種濃度（1、10、100 μmol/L）的測試化合物添加到細胞中孵育24 h。孵育后，使用葡萄糖測定試劑盒通過葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。正常對照組為90 μL 培養(yǎng)基＋10 μL 生理鹽水，樣品組為90 μL 培養(yǎng)基＋10 μL 樣品，按公式計算樣品促進細胞葡萄糖消耗率。

促進細胞葡萄糖消耗率＝(正常對照組葡萄糖含量－樣品組葡萄糖含量)/正常對照組葡萄糖含量。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1、2 的1H-NMR 及13C-NMR 數(shù)據(jù)(600/150MHz，CD3OD)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data(600/150MHz，CD3OD)for compounds 1 and 2

圖1 化合物1 和2 主要的1H-1H COSY、HMBC 相關(guān)Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compounds 1 and 2

與文獻數(shù)據(jù)[11]對照，并根據(jù)H-1(δ2.16,ddd,J=12.5,9.6,2.6 Hz)可以推斷H-1 為β 取向，根據(jù)H-1 與H-2(δ1.85)，H-6 與H-2(δ1.65)的NOE 相關(guān)（圖2）可以推斷H-6 為α 取向。根據(jù)H-12(δ4.12,t,J=4.1 Hz)可推斷12-OH 為β 構(gòu)型。進一步使用CPCM模型在甲醇中針對(1S,6S,12R)-1a和(1S,6R,12S)-1b 在B3LYP/6-31＋g(d,p)計算水平上計算得到的ECD 譜，結(jié)果表明計算出的(1S,6S,12R)-1a ECD譜與實驗ECD 譜吻合，因此確定了化合物1 的絕對構(gòu)型，命名為6β,12β-二羥基-4(5),7(8)-玉米二烯。

圖2 化合物1 和2 主要的NOESY 相關(guān)Fig.2 NOESY correlations of compounds 1 and 2

根據(jù)H-8,H-10 與偕二甲基H-13,H-14 均有NOE 相關(guān)，可以推斷出H-8,H-10 為β 取向，參照文獻報道[11]及H-1 與H-8 具有NOE 相關(guān)（圖2），確定H-1 為β 取向。進一步使用CPCM 模型在甲醇中針對(1R,8R,10R)-2a 和(1R,8S,10S)-2b 在B3LYP/6-31＋g(d,p)計算水平上計算得到的ECD譜，計算出的(1R,8R,10R)-2a ECD 譜與實驗ECD譜吻合，因此確定了化合物2 的絕對構(gòu)型，命名為8α,10α-二羥基-4(5),7(12)-玉米二烯。

化合物3：白色粉末；mp 175～177 ℃；1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:3.64(3H,s,-OCH3),2.30(1H,t,J=7.4 Hz,H-1′),1.61(4H,m,H-2′,6′),1.32(6H,m,H-3′～5′)；13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:174.6(C-1),50.5(-OCH3),33.4(C-1′),28.6(C-2′,6′),24.6(C-3′,5′),28.7(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物3 為環(huán)己甲酸甲酯。

化合物4：白色粉末；mp 168～170 ℃；1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.04(2H,m,H-2,6),6.79(2H,m,H-3,5),3.49(2H,q,J=6.6 Hz,H-2′),2.74(2H,t,J=6.6 Hz,H-1′),1.95(3H,s,H-4′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.1(C-3′),154.6(C-4),130.8(C-1),129.9(C-2,6),115.5(C-3,5),40.8(C-2′),34.7(C-1′),23.4(C-4′)。該結(jié)果與合成的氮乙酰對羥基苯乙胺一致[13]，故鑒定化合物4 為氮乙酰對羥基苯乙胺。

3.2 腫瘤細胞抑制活性及葡萄糖消耗活性

以阿霉素為陽性對照，化合物1、2 在1、10、100 μmol/L 時，測試對人體外腫瘤細胞株T-24、SK-OV-3 的抑制活性。結(jié)果顯示，在濃度為10.0 μmol/L 時，表現(xiàn)出一定活性，見表2。

表2 化合物1、2(100 μmol·L?1)對SK-OV-3、T-24 的抑制率Table 2 Inhibition rate of compounds 1 and 2 in SK-OV-3 and T-24 cells

結(jié)果表明，化合物 1 對人體腫瘤細胞株SK-OV-3 及T-24 的抑制率分別為11.86%、18.64%，顯示出一定的抑制活性，化合物2 則相對更弱。對HeLa、MCF-7、BGC-823 細胞基本沒有抑制活性。

化合物1、2 的葡萄糖消耗活性測試結(jié)果見表3。由該結(jié)果可知，化合物1、2 在10.0 μmol/L 濃度對HepG2 細胞中葡萄糖消耗顯示一定促進作用，消耗率分別為10.30%、9.80%。

表3 化合物1、2 在HepG2 細胞中的促進葡萄糖消耗率Table 3 Glucose consumption of compounds 1 and 2 in HepG2 cells

4 討論

玉米須在中醫(yī)用藥及民間均有作降糖用，化合物1、2 在結(jié)構(gòu)上屬倍半萜類，對HepG2 細胞中葡萄糖消耗顯示一定的促進作用，由此推測玉米須的降糖作用可能與該類倍半萜化合物有關(guān)，將在后續(xù)研究中進一步驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突