劉 玲，倪恒凡，邱 翔，朱 呂，王 歡，譚 艷，張舜杰，李先登，萬(wàn) 麗*，趙 旻

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

2.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041

藏木香為菊科（Asteraceae）旋覆花屬I(mǎi)nulaL.植物總狀土木香Inula racemosaHook.f.的干燥根，藏藥名為“瑪奴”[1]。其性溫，味苦、辛，具有行氣化瘀、溫中止吐、調(diào)氣解郁、驅(qū)蟲(chóng)利尿、止痛之功效[2]。在眾多經(jīng)典藏方如四味藏木香湯散[3-4]等中廣泛應(yīng)用，在治療消化不良[4]、慢性萎縮性胃炎[5]、血隆相關(guān)疾病[4]等方面療效確切。而現(xiàn)代藥理研究亦表明藏木香中多種降倍半萜、桉烷型及愈創(chuàng)木型倍半萜在抗炎方面具有顯著的抑制活性[7-8]。因此，本研究以考察對(duì)尼日利亞菌素（nigericin）誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病 THP-1 細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的抑制作用為導(dǎo)向，追蹤藏木香中的活性成分，從其干燥根乙醇提取物的石油醚萃取部分分離純化得到1 個(gè)活性倍半萜，利用現(xiàn)代波譜技術(shù)和化學(xué)水解方法對(duì)該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定化合物1為新的桉烷型倍半萜，命名為藏木香素I。為準(zhǔn)確驗(yàn)證該結(jié)構(gòu)，使用0.2 mol/L NaOH對(duì)其進(jìn)行水解，得到水解產(chǎn)物為isotelekin（1a）和3-苯甲?；┧幔?b）。結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。體外活性實(shí)驗(yàn)表明化合物1 對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 的釋放具有顯著的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為2.1 μmol/L。采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)法確定給藥后nigericin誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中LDH 的釋放以判斷化合物的抗炎作用是否源于其細(xì)胞毒性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，結(jié)果表明該化合物不僅對(duì)THP-1 細(xì)胞不具有毒性，而且可抑制nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞死亡，對(duì)THP-1 細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

圖1 化合物1 及其水解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1 and its alkaline hydrolysis products

1 儀器與材料

Bruker Ascend 400 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；Waters Synapt G2 型高分辨率質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Perkin Elmer one FT-IR 型紅外光譜計(jì)（美國(guó)PerkinElmer 公司）；Anton Paar MCP200 型旋光儀（美國(guó)Anton Paar 公司）；Shimadazu UV-2600/2700 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadazu 公司）；Ultimate3000 賽默飛高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；Capcell pak C18分析型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Shiseidao 公司）；NP7000 型半制備液相色譜儀（江蘇漢邦科技有限公司）；Kromasil C18半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，瑞典Akzo Nobel 公司）；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；50 μm ODS反相C18填料（日本YMC 公司）；50 μm MCI樹(shù)脂（日本Mitsubishi Chemical 公司）。實(shí)驗(yàn)所用試劑：氘代試劑（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）；色譜純甲醇[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；人THP-1 外周血單核細(xì)胞樣細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；opti-MEM（美國(guó)Gibco 公司）；脂多糖（美國(guó)Sigma Aldrich 公司）；LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega 公司，CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）

研究所用藏木香藥材于2020年1月采自西藏拉薩市林周縣，由成都中醫(yī)藥大學(xué)萬(wàn)麗教授鑒定為菊科旋覆花屬植物藏木香I.racemosaHook.f.的干燥根，樣本（HX20200130）存放于四川大學(xué)華西醫(yī)院。

2 提取與分離

藏木香鮮藥材洗凈泥沙，趁鮮切片后，放陰涼通風(fēng)處自然晾干。晾干后的干燥根約6.5 kg 粉碎過(guò)2 號(hào)篩，用50 L 95%乙醇浸泡提取3 次，每次浸泡4 d。減壓抽濾提取液后減壓濃縮至浸膏，得乙醇提取物1056 g。接著將該乙醇提取物分散于5 L 水中，分別用石油醚、二氯甲烷、和醋酸乙酯各5 L 進(jìn)行萃取，重復(fù)3 次，減壓濃縮得到各萃取浸膏（254、202、280、300 g）。采用ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各萃取部位對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 的釋放的抑制作用，確定石油醚萃取部位為主要活性部位。將該石油醚浸膏用MCI 柱色譜去除色素，以90%甲醇進(jìn)行洗脫，濃縮洗脫液，得淡黃色浸膏85 g。采用硅膠柱色譜對(duì)該石油醚部位進(jìn)行分離，以石油醚-醋酸乙酯體系（100∶1～1∶1）進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜（TLC）合并得到8 個(gè)組分（A～H），并同樣利用nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞進(jìn)行活性篩選，確定組分B 的活性最好。將組分B（6.8 g）經(jīng)ODS 中壓柱色譜，以10%～100%甲醇梯度洗脫，每100 mL 收集1 份，根據(jù)TLC 檢視[石油醚-醋酸乙酯（5∶1）]合并得到10 個(gè)組分Fr.1～10。經(jīng)活性篩選后，將活性組分Fr.8（556 mg）經(jīng)半制備HPLC 色譜，用體積分?jǐn)?shù)為85%甲醇，體積流量3 mL/min 等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 和254 nm，分離得到化合物1（20 mg，tR＝10.31 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀液體，[α]20D-9(c0.5,CHCl3)。HR-ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z:429.167 6[M＋Na]+（計(jì)算值為 429.167 8，C25H26O5Na），故化合物分子式為C25H26O5，不飽和度為13。紅外光譜顯示羰基（1764、1717、1671 cm-1）、苯環(huán)（1159、1017、978 cm-1）等特征信號(hào)。1H-NMR 譜（表1）顯示有26 個(gè)氫信號(hào)，包括1 組單取代的芳香共振質(zhì)子信號(hào)δH7.99(2H,dd,J=7.6,1.2 Hz),7.63(1H,tt,J=7.5,1.2 Hz,),7.51(2H,t,J=7.5 Hz)；1 組反式共軛烯氫信號(hào)δH7.90(1H,d,J=15.5 Hz,H-3′)和6.89(1H,d,J=15.5 Hz,H-2′)；4個(gè)烯氫質(zhì)子信號(hào)δH6.14(1H,s,13β),5.59(1H,s 13α),5.20(1H,s,15β),4.76(1H,s,15α)；以及1 個(gè)甲基信號(hào)δH0.86(3H,s,H-15)。通過(guò)DEPT 譜還可以確定6 個(gè)亞甲基信號(hào)δC120.6(C-13),113.3(C-15)，41.0(C-9),36.5(C-1),27.1(C-2)和27.0(C-6)；4 個(gè)次甲基信號(hào)δC76.7(C-3),76.6(C-6),41.6(C-5)和40.5(C-7)；以及7 個(gè)季碳信號(hào)。結(jié)合HSQC 譜對(duì)上述基團(tuán)對(duì)應(yīng)的一維信號(hào)進(jìn)行歸屬。在HMBC 譜中可觀察到H-1 與C-3、C-5、C-9 和C-14 之間存在遠(yuǎn)程相關(guān)；H-2 與C-4 和C-10 之間有遠(yuǎn)程相關(guān)；H-5與C-7、C-9 和C-14 之間存在遠(yuǎn)程相關(guān)；H-6與C-10、C-11 之間有遠(yuǎn)程相關(guān)；H-9 與C-1、C-7 和C-14 之間存在遠(yuǎn)程相關(guān)；結(jié)合1H-1H COSY 譜中H-1/H-2/H-3 和H-5/H-6/H-7/H-8/H-9 相鄰質(zhì)子之間給出的相關(guān)信號(hào)；證明了2 個(gè)六元環(huán)是通過(guò)5、10位碳進(jìn)行駢合。此外，根據(jù)HMBC 譜中H-7 與C-12、C-13 和C-9 之間的遠(yuǎn)程相關(guān)；H-13 與C-11、C-12和C-7 之間的遠(yuǎn)程相關(guān)，以及H-8 與C-12 之間存在的遠(yuǎn)程相關(guān)，可以推測(cè)出C-8 位羥基與連接在C-7位上的異丙烯酸形成內(nèi)酯。最后，可根據(jù)H-15 與C-4、C-3 的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)確定C-4 位的雙鍵位置，而連在C-11 位的雙鍵位置則由H-13 與C-11、C-12、C-7 的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)確定。至此，經(jīng)文獻(xiàn)檢索綜合判斷可知，該部分信號(hào)與桉烷型倍半萜內(nèi)酯isotelekin[9]非常吻合。剩余部分根據(jù)HMBC 譜給出的H-6′與C-4′、C-5′和C-8′之間的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，H-3′與C-1′、C-5′之間的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，以及H-3′與C-4′之間的遠(yuǎn)程相關(guān)；并結(jié)合1H-1H COSY 譜中H-6′/H-7′/H-8′/H-9′/H-10′和H-3′/H-2′的相關(guān)信號(hào)；推測(cè)此部分結(jié)構(gòu)與和3-苯甲?；┧醄10]非常相似。同時(shí)，根據(jù)HMBC 譜中的H-3(δH5.50)與C-1′(δC164.7)的遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)可以確定該化合物可能是由3-苯甲酰基丙烯酸與isotelekin 的C-3位羥基形成酯鍵相連而成。綜上所述，化合物1 的平面結(jié)構(gòu)鑒定完成（圖2）。另外，化合物的相對(duì)構(gòu)型可以通過(guò)NOESY 譜中H-5 與H-7 和H-8 之間，H-3 與H-14 之間，以及H-2′與H-6′之間的相關(guān)信號(hào)得到判斷（圖3）。

表1 化合物1 的1H-NMR(400 MHz,CDCl3)和13C-NMR(100 MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)Table 1 1H NMR(400 MHz,CDCl3)and 13C NMR(100 MHz,CDCl3)data for compound 1

圖2 化合物1 的主要HMBC 和1H-1H COSY 相關(guān)Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

圖3 化合物1 的主要NOESY 相關(guān)Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

由于該化合物的手性中心全部存在于桉烷型倍半萜的母核結(jié)構(gòu)上，因此只要判斷出母核的絕對(duì)構(gòu)型就可以鑒定此化合物的絕對(duì)構(gòu)型。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)水解法對(duì)化合物1 絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行確定[11-12]，用0.2 mol/L NaOH 對(duì)其進(jìn)行水解，反應(yīng)完成后加5%稀鹽酸進(jìn)行中和，用醋酸乙酯萃取，萃取產(chǎn)物經(jīng)半制備液相分離純化得到水解產(chǎn)物1a 和1b。通過(guò)與已知化合物的波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物1a 和1b 分別為isotelekin 和3-苯甲?；┧?。綜上所述，化合物1 的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，為新的桉烷型倍半萜內(nèi)酯，命名為藏木香素I。

化合物1a：類(lèi)白色結(jié)晶狀固體，[α]20D＋92(c0.5,CHCl3)，HR-ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z271.130 8[M＋Na]+（計(jì)算值為271.131 0），確定分子式為C15H20O3。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.06(1H,d,J=0.8 Hz,H-13β),5.54(1H,d,J=0.6 Hz,H-13α),4.92(1H,s,H-15β),4.51(1H,s,H-15α),4.45(1H,td,J=4.8,1.4 Hz,H-8),4.25(1H,t,J=2.7 Hz,H-3),2.95(1H,m,H-7),2.37(1H,dd,J=12.5,1.6 Hz,H-5),2.13(1H,dd,J=15.4,1.3 Hz,H-9β),1.70～1.60(4H,m,H-2α,2β,6β,9α),1.52(1H,dd,J=15.7,4.7 Hz,H-1β),1.33～1.19(2H,m,H-1α,6α),0.74(3H,s,H-14)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:170.7(C-12),150.2(C-4),142.1(C-11),120.2(C-13),109.6(C-15),76.9(C-8),73.1(C-3),40.9(C-9),40.4(C-5),40.1(C-7),35.7(C-1),34.1(C-10),29.1(C-2),27.0(C-6),16.9(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[9,13]，故鑒定化合物1a 為isotelekin。

化合物1b：白色粉末狀固體，HR-ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z199.036 8[M＋Na]+（計(jì)算值為199.037 1），確定分子式為C10H8O3。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.02(2H,J=7.7 Hz,H-7,9),7.87(1H,d,J=15.6 Hz,H-3),7.71(1H,t,J=7.4 Hz,H-8),7.58(2H,t,J=7.7 Hz,H-6,10),6.68(1H,d,J=15.6 Hz,H-2)；13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:189.6(C-4),166.4(C-1),136.3(C-5),136.2(C-3),134.1(C-8),133.0(C-2),129.1(C-7,9),128.8(C-6,10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)一致[10,14]，故鑒定化合物1b 為3-苯甲?；┧?。

4 對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 釋放的抑制作用

根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[15]采用ELISA 法檢測(cè)IL-1β的釋放，評(píng)價(jià)化合物1 對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 釋放的抑制活性，以半數(shù)抑制濃度（IC50）表示，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。結(jié)果表明，化合物1 對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 的釋放具有顯著的抑制作用，IC50為2.1 μmol/L，而陽(yáng)性藥姜黃素為5 μmol/L。

5 LDH 試驗(yàn)

為排除化合物1 對(duì)IL-1β 釋放的抑制作用可能由于其細(xì)胞毒性導(dǎo)致的THP-1 細(xì)胞死亡所致，采用LDH 法檢測(cè)對(duì)給藥后nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中LDH 的釋放量，以此來(lái)進(jìn)行細(xì)胞死亡分析，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。結(jié)果表明（圖4），化合物1 不僅對(duì)THP-1 細(xì)胞無(wú)毒性作用，還能以劑量相關(guān)的方式減輕nigericin 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，說(shuō)明其對(duì)THP-1 細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。

圖4 LDH 法檢測(cè)化合物1 處理后nigericin 誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中LDH 的釋放量Fig.4 LDH release in supernatants from nigericin-induced THP-1 cells treated with compound 1

6 討論

本實(shí)驗(yàn)利用多種色譜分離技術(shù)及天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定方法，通過(guò)活性追蹤從藏木香中分離得到藏木香素I，該化合物對(duì)nigericin 誘導(dǎo)的THP-1 細(xì)胞中IL-1β 釋放具有顯著的抑制作用，且無(wú)細(xì)胞毒性，可為藏木香的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突