王紅芳 余細(xì)球 葉靜 范昭

微小核糖核酸(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子核糖核酸(RNA),可以特異性結(jié)合靶細(xì)胞mRNA,調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1,2］。其中miR-34 在很多腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失,從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)增加,具有抑癌基因作用,如B 細(xì)胞淋巴瘤-2(bcl-2)、白細(xì)胞分化抗原44(cd44)、Noch1 等［3］。survivin 作為凋亡抑制蛋白,是miR-34a 的靶基因之一,在細(xì)胞增殖和凋亡平衡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù),檢測(cè)miR-34 和survivin 基因在人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況,探討二者與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 臨床資料和標(biāo)本取自2015 年1 月～2017 年12 月深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院和深圳市北大深圳醫(yī)院32 例患者手術(shù)切除的新鮮組織,其中32 份結(jié)腸癌組織(腺癌)標(biāo)本作為癌癥組,32 份癌旁組織標(biāo)本(據(jù)切緣＞2 cm)作為癌旁組,均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí),且在-80℃條件下速凍保存。其中男20 例,女12 例；年齡41～73 歲,平均年齡(59.2±6.1)歲。所有標(biāo)本收集均得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),獲得患者知情同意并簽字。

1.2方法

1.2.1總RNA 提取和miRNA 反轉(zhuǎn)錄 50 mg 組織剪碎后,按照Trizol(Invitrogen) 說(shuō)明書提取總RNA,用分光光度儀檢測(cè)提取總RNA 含量和純度,抽提的RNA A260/A280為1.7～2.0。取 總RNA 1 μg,用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：2×miRNA Reaction Buffer Mix 5 μl,0.1%BSA 1 μl,miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl,用水補(bǔ)至10 μl,反應(yīng)條件：37℃ 60 min,85℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后,用不含RNA 酶的水稀釋體系至50 μl,取1 μl 進(jìn)一步做熒光定量 PCR。

1.2.2熒光定量PCR 分析引物均由上海生物工程有限公司合成,miR-34a 引物序列：tggcagtgtcttagctggttg ；miR-34b/c 引物序列：caatcactaactccactgccat；survivin 引物上游序列：cacctgaaagcttcctcgac,下游序列：tctaacctgccattggaacc；U6 引物上游序列：ctcgcttcggcagcaca,下游序列：aacgcttcacg aatttgcgt。

反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl,上下游引物各1 μl(10 μM),cDNA 1 μl,用水補(bǔ)至20 μl 體系。每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔,以U6 作為內(nèi)參,同時(shí)每個(gè)基因設(shè)立陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)后95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。

1.3觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較miR-34 和survivin基因在癌癥組和癌旁組中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平?；虮磉_(dá)相對(duì)量采用癌癥組/癌旁組=2-△△CT進(jìn)行計(jì)算,其中△△CT=△CT癌癥組(CT目的基因-CT內(nèi)參)平均值-△CT癌旁組(CT目的基因-CT內(nèi)參)平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

miR-34a 和miR-34b/c 基因表達(dá)在癌癥組組織中均低于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在癌癥組組織中miR-34b/c 表達(dá)較miR-34a 水平降低更顯著,survivin 表達(dá)增加較癌旁組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 與survivin 在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.43、-0.51,P＜0.05)。見表1。

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表達(dá)水平(,%)

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表達(dá)水平(,%)

注：與癌旁組比較,aP＜0.05；與癌癥組survivin 比較,bP＜0.05

3 討論

miR-34 可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞衰老,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻止細(xì)胞遷移等,被認(rèn)為是抑癌基因,其家族包括miR-34a、miR-34b 和miR-34c,在不同的物種中均具有高度的保守性。人miR-34a 基因定位于染色體1p36.22,miR-34b 和miR-34c定位于染色體11q23.1,由同一初始轉(zhuǎn)錄子所編碼。研究發(fā)現(xiàn),miR-34 的調(diào)控基因均位于基因組脆性位點(diǎn)區(qū)域,在腫瘤中這些區(qū)域染色體常發(fā)生擴(kuò)增、缺失或重排,易造成基因表達(dá)的改變,從而促進(jìn)多種疾病的發(fā)生,與許多惡性腫瘤的形成相關(guān)［3-5］。

隨著對(duì)miR-34 家族的研究深入,利用其可以調(diào)節(jié)多種蛋白抑制腫瘤生長(zhǎng)這一生物學(xué)特點(diǎn),已有研究把miR-34 家族作為治療惡性腫瘤的靶點(diǎn)［6］,而導(dǎo)入miR-34 類似物或其前體補(bǔ)充缺失的miR-34 功能,在體內(nèi)外均可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)其凋亡,且對(duì)正常組織和細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒副作用,所以認(rèn)為miR-34可作為惡性腫瘤的治療靶點(diǎn),有極佳的應(yīng)用前景［7,8］。但miR-34 在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)、調(diào)節(jié)和預(yù)后等缺乏系統(tǒng)研究,觀點(diǎn)也不盡相同。

研究發(fā)現(xiàn)miR-34 和結(jié)腸癌干細(xì)胞之間有聯(lián)系,miR-34 的丟失會(huì)引起結(jié)腸癌干細(xì)胞/祖細(xì)胞增多,導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲性發(fā)展［9］。在Wan 等［10］研究中,片仔癀可以通過(guò)上調(diào)miR-34c-5p 的表達(dá)來(lái)抑制結(jié)腸癌HCT-8 細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 和S 期之間。與正常結(jié)腸黏膜組織相比,miR-34a 和miR-34b/c在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)；在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失,這些與其啟動(dòng)子區(qū)超甲基化有關(guān)［11］。這些研究都支持miR-34 作為抑癌基因在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用。而Mudduluru 等［12］和Hiyoshi 等［13］的研究觀點(diǎn)相反,認(rèn)為miR-34 在結(jié)腸癌中可能是癌基因。Hiyoshi 等［13］用定量RT-PCR 技術(shù)對(duì)159 例美國(guó)和113 例中國(guó)結(jié)腸癌和癌旁正常組織進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)所有miR-34 家族成員在結(jié)腸腫瘤中表達(dá)均明顯增加；運(yùn)用激光顯微切割技術(shù),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-34b/c 在腫瘤間質(zhì)組織中表達(dá)增加更顯著,該結(jié)果與結(jié)腸癌預(yù)后不良有關(guān),推測(cè)miR-34 可能作為癌基因參與結(jié)腸癌進(jìn)展。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 在癌癥組中表達(dá)水平分別是癌旁組的56%和49%,均低于癌旁組,尤其miR-34b/c 更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),支持miR-34 家族在結(jié)腸癌組織中作為抑癌基因發(fā)揮作用。

survivin 基因是凋亡抑制蛋白基因家族中非常重要的一員,在大多數(shù)惡性腫瘤中都有表達(dá),主要功能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡,維系二者之間的平衡。有研究顯示survivin 基因是miR-34a 作用的靶基因之一。在喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2 中,miR-34a 過(guò)表達(dá)可以引起Hep2 細(xì)胞活力下降,凋亡增加,細(xì)胞遷徙和侵襲力降低；survivin 和Ki-67 基因表達(dá)水平也相應(yīng)下調(diào),認(rèn)為miR-34a 在喉鱗狀細(xì)胞癌中是一個(gè)負(fù)性的miRNA,通過(guò)抑制survivin 和Ki-67 基因表達(dá),抑制增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。在人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞(T24)中,miR-34a 表達(dá)量明顯低于正常人膀胱上皮細(xì)胞,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-34a 類似物后,隨著T24 細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)上升,Survivin 蛋白的表達(dá)明顯降低,細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力也顯著降低［15］。以上研究均支持miR-34a 通過(guò)抑制其靶基因survivin 調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。

相關(guān)研究在人結(jié)腸癌組織中尚未見報(bào)道。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 基因表達(dá)在癌癥組組織中均低于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在癌癥組組織中miR-34b/c 表達(dá)較miR-34a 水平降低更顯著,survivin 表達(dá)增加較癌旁組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 與survivin 在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05),與前面研究一致。

綜上所述,miR-34 家族在結(jié)腸癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用,可以負(fù)性調(diào)節(jié)survivin 的表達(dá),可以做為臨床診治結(jié)腸癌的的新靶點(diǎn)。