付 娟，姜朝麗，王天剛，趙 龍，晉小寧，李 志

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，四川瀘州 646000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是消化系統(tǒng)常見的急腹癥之一，盡管大多數(shù)AP 具有自限性，但仍有20%～30%可發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），其并發(fā)癥多、病情兇險(xiǎn)，院內(nèi)病死率高達(dá)15%[1]。SAP不僅引起胰腺局部的炎癥反應(yīng)，也常引起胰腺以外多器官損傷，肝臟為主要損傷器官之一，肝衰竭是SAP 患者死亡的主要影響因素之一，發(fā)生率高達(dá)83%[2]。目前重癥急性胰腺炎肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有關(guān)研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)為關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制[3-6]，因此早期阻斷或抑制氧化應(yīng)激對(duì)防治SAP 合并肝損傷，保護(hù)肝功能至關(guān)重要。本研究通過觀察柴黃清胰活血方對(duì)SAP 模型大鼠血清淀粉酶（AMY）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響，對(duì)比用藥后超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、血紅素加氧酶-1（HO-1）等氧化應(yīng)激水平的變化，探討柴黃清胰活血方對(duì)SAP 模型大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠128只，體重（250±30）g，8 周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030）]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào):2020885）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

柴黃清胰活血方成藥由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，通過相關(guān)工藝制成流浸膏，流浸膏生藥含量為2.02 g/g（批號(hào):20180602），本次實(shí)驗(yàn)用量為1.2 g/kg。?；悄懰徕c（sigma，批號(hào)：#SLBT9650）；戊巴比妥鈉（天津蘭洪新能源科技公司，批號(hào)：170108）；HE 染色試劑盒（Solarbio，批號(hào)：20191015）；MDA、T-SOD、GSH-PX、CAT、ALT、AST 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A003-1-2，A001-1-2，A005-1-2，A007-1-1，C009-2-1，C010-2-1）；山羊抗鼠IgG（Bioss，批號(hào)：AG05187292）；山羊抗兔IgG、HO-1抗體（購自CST，批號(hào)：27、1#$UNIVPA19-07003308_25）；總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，批號(hào)：#S7801）等；Real-time PCR引物由成都擎科生物有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

1.3 動(dòng)物模型制備、分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后SD 大鼠隨機(jī)分為4 組（n1=32），即Blank、Sham、SAP 和Chaihuang 組；各組再分6 h、12 h、24 h、48 h 4 個(gè)亞組（n=8）。于實(shí)驗(yàn)前12 h開始禁食，但不禁水，稱重后，以1%戊巴比妥鈉（6 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，再固定，剃毛備皮，消毒，鋪巾，沿腹中線于劍突下剪一長2～3 cm切口，逐層入腹，找到十二指腸和胰腺，在近肝門處用小動(dòng)脈夾閉暫時(shí)性阻斷胰膽管，清潔磨鈍尾靜脈針頭沿十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸壁無血管區(qū)緩慢進(jìn)入胰膽管約0.5 cm，0.1 mL/min 緩慢勻速推注5%?；悄懰徕c（1 mL/kg BW），拔針后壓迫穿刺點(diǎn)5 min，當(dāng)胰腺組織開始腫脹并初步呈現(xiàn)充血、點(diǎn)狀出血征象時(shí)，初步判斷模型制備成功，觀察造模成功后，松開動(dòng)脈夾并逐層縫合關(guān)腹。Sham 組開腹后僅翻動(dòng)胰腺和十二指腸即逐層縫合關(guān)腹，Blank 組不予任何干預(yù)。術(shù)后背部皮下注射4 mL 生理鹽水補(bǔ)充術(shù)中失水，術(shù)后自由飲水，注意保暖。麻醉蘇醒后，Chaihuang 組灌胃柴黃清胰活血方流浸膏藥液（1.2 g/kg），Sham組和SAP組灌胃給予生理鹽水（10 mL/kg），均隔6 h給藥1次。

1.4 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè)

術(shù)后6、12、24、48 h 分批取材各組8 只大鼠，取材時(shí)沿原切口剪開腹腔，觀察大鼠腹腔、胰腺、肝組織的大體形態(tài)變化。腹主動(dòng)脈取血，靜置后離心-20 ℃保存以備生化檢測(cè)；10%甲醛固定部分新鮮肝臟組織備測(cè)病理檢查（參Camarg法進(jìn)行雙盲病理評(píng)分）；余下部分制備勻漿凍存于-80 ℃冰箱備測(cè)Western Blot、RT-PCR，各項(xiàng)指標(biāo)均按試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重癥急性胰腺炎模型大鼠制備后胰腺及腹腔觀察

大鼠胰腺呈不同程度的充血、水腫，部分可見出血、壞死和脂肪皂化斑；HE 染色可見葉間隙腺泡間隙明顯擴(kuò)張，部分腺泡壞死，壞死灶內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤；腹腔可見淡黃色或血性渾濁腹水，腸管顏色變暗，管壁充血水腫明顯，腸腔內(nèi)積聚大量糞便和液體，腹腔臟器呈不同程度粘連，表明重癥急性胰腺炎大鼠模型制備成功，見圖1。

圖1 大鼠胰腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，× 200）

2.2 HE染色肝組織的光鏡下觀察及病理學(xué)評(píng)分

Blank組和Sham組肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，未見細(xì)胞凋亡、壞死及炎細(xì)胞浸潤等改變，兩組對(duì)比無明顯差異。SAP組6 h肝細(xì)胞水腫，空泡形成，少許紅細(xì)胞堆積和炎細(xì)胞浸潤；12 h肝索排列紊亂，點(diǎn)狀細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤增加；24 h 肝血竇擴(kuò)張，組織間紅細(xì)胞充盈，見較多細(xì)胞嗜酸性變，壞死面積增大；48 h 肝細(xì)胞水腫較24 h 稍減輕，肝索排列紊亂，仍見炎細(xì)胞浸潤。Chaihuang 組較同時(shí)間點(diǎn)SAP 組，肝細(xì)胞損傷明顯減輕，小葉結(jié)構(gòu)尚存，炎性浸潤和細(xì)胞嗜酸性變少見，未見明顯肝細(xì)胞壞死，見圖2。Sham 組與Blank 組比較，肝臟組織病理評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；SAP組、Chaihuang組較Sham組病理評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；Chaihuang 組病理評(píng)分較SAP組降低（P＜0.05），見表2。

圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，× 200）

表2 各組大鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分（x±SD，n=8）

2.3 大鼠血清AMY、ALT、AST比較

與Blank 組相比，Sham 組血清AMY、ALT、AST水平無明顯差異（P ＞0.05）。與Sham組相比，SAP組和Chaihuang 組各時(shí)點(diǎn)AMY、ALT、AST 含量均明顯升高（P＜0.05）。與SAP組相比，Chaihuang組各時(shí)點(diǎn)AMY、ALT 含量均顯著降低（P＜0.05）；12、24、48 h AST 水平明顯降低（P＜0.05），6 h AST 水平無明顯差異（P ＞0.05），見圖3～圖5。

圖3 各組大鼠AMY比較

圖4 各組大鼠ALT比較

圖5 各組大鼠AST比較

2.4 大鼠肝組織S〇D、CAT、GSH-Px、MDA比較

與Blank 組相比，Sham 組SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平未見明顯差異（P ＞0.05）。與Sham組相比，6、12、24 h SAP 和12 h Chaihuang 組SOD 水平降低（P＜0.05）；各時(shí)點(diǎn)SAP 組和Chaihuang 組CAT、GSH-Px 水平均明顯降低（P＜0.05）；12、24、48 h SAP 組MDA 水平明顯升高（P＜0.05）。與SAP 組相比，Chaihuang 組各時(shí)點(diǎn)CAT 水平較高（P＜0.05）；12、24、48 h Chaihuang 組GSH-Px 水平升高（P＜0.05）；12、24、48 h Chaihuang 組MDA 水平降低（P＜0.05），見圖6～圖9。

圖7 各組大鼠肝組織CAT比較

圖8 各組大鼠肝組織GSH-Px比較

圖9 各組大鼠肝組織MDA比較

2.5 大鼠肝組織H〇-1 mRNA表達(dá)比較

與Blank組相比，Sham組HO-1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異（P ＞0.05）。SAP 和Chaihuang 組各時(shí)間點(diǎn)較Sham 組HO-1 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。12、24、48 h Chaihuang組HO-1 mRNA水平較SAP組更高（P＜0.05），見圖10。

圖10 各組大鼠肝組織H〇-1 mRNA比較

2.6 大鼠肝組織H〇-1蛋白表達(dá)比較

與Blank組相比，Sham組HO-1蛋白表達(dá)無明顯差異（P ＞0.05）；6、12、24 h SAP 組和Chaihuang 組HO-1 水平較Sham 組明顯升高（P＜0.05）。Chai?huang 組6、12、24 h HO-1 蛋白表達(dá)較SAP 組更高（P＜0.05），見圖11。

圖11 各組大鼠肝組織H〇-1蛋白比較

3 討論

SAP 為臨床危急重癥，極易合并多器官功能損害，以肝臟為主要損傷器官，且與病情程度呈正相關(guān)[2]。SAP 合并肝功能損害較為復(fù)雜，ALT、AST 是急性肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志，廣泛運(yùn)用于肝功能及SAP 肝損傷評(píng)價(jià)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組和柴黃組ALT、AST活性明顯高于假手術(shù)組，柴黃組總體水平低于模型組，結(jié)合AMY 含量的改變，提示造模后大鼠確有不同程度的肝功能受損，而柴黃清胰活血方對(duì)SAP模型大鼠肝損傷有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AP發(fā)病機(jī)制的重要調(diào)節(jié)器，是指機(jī)體受各種因素刺激造成氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，導(dǎo)致組織損傷，干擾器官正常代謝活動(dòng)的一種應(yīng)激狀態(tài)[9]。在SAP病程進(jìn)展過程中胰腺腺泡細(xì)胞受損產(chǎn)生大量的氧自由基，過量的氧自由基可視為重要的炎性介質(zhì)加重胰腺局部的炎癥反應(yīng)，且可增加毛細(xì)血管通透性，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，釋放大量有毒物質(zhì)引起扳機(jī)樣級(jí)聯(lián)放大連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致胰腺及胰外多臟器損傷等改變，尤其是肝臟。有研究[10]表明脂質(zhì)過氧化的加重和抗氧化水平的下降加重了AP模型大鼠的肝損傷，評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過檢測(cè)氧化應(yīng)激中間產(chǎn)物，如MDA可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度；亦或檢測(cè)體內(nèi)抗氧化酶，如SOD、CAT、GSH-Px等可間接反映機(jī)體清除活性氧的能力。本實(shí)驗(yàn)研究制備SAP 大鼠模型后，病理結(jié)果顯示模型大鼠存在明顯肝損傷，其肝索排列紊亂，伴不同程度的細(xì)胞嗜酸性變、肝細(xì)胞壞死亦或炎性細(xì)胞浸潤；肝組織SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，表明肝損傷進(jìn)程存在明顯的氧化應(yīng)激失平衡改變。而柴黃組SOD、GSH-Px、CAT 水平明顯高于模型組，MDA 活性低于模型組，提示柴黃清胰活血方可恢復(fù)肝組織氧化和抗氧化平衡，增強(qiáng)抗氧化、減弱過氧化以保護(hù)SAP并發(fā)肝損傷。

HO-1是血紅素降解的限速酶，能夠在代謝過程中發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖的作用，已成為一種重要的防御分子[11]。Zhang 等[12]實(shí)驗(yàn)證明HO-1通過抗炎和抗氧化機(jī)制減少脂質(zhì)過氧化，防止細(xì)胞凋亡或衰竭，降低胰腺和肝臟損傷相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，尤其在減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)胰腺和肝臟等器官免受損傷方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定SAP 模型大鼠肝組織HO-1 蛋白和mRNA 的表達(dá)，結(jié)果表明柴黃組和模型組較假手術(shù)組數(shù)值升高，結(jié)合組織病理學(xué)結(jié)果提示HO-1 參與SAP 并發(fā)肝損傷過程，證實(shí)了HO-1 是一種細(xì)胞保護(hù)酶，在炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下可啟動(dòng)機(jī)體適應(yīng)性（代償性）保護(hù)機(jī)制[11-12]；而柴黃組HO-1 水平較模型組更高，提示柴黃清胰活血方可通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的上調(diào)對(duì)SAP模型大鼠肝損傷起到保護(hù)作用。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為SAP多因酒食不節(jié)、情志失舒、外邪侵襲、蟲積內(nèi)擾等導(dǎo)致濕、熱、瘀、毒結(jié)聚中焦，脾胃升降傳導(dǎo)失司，肝膽氣機(jī)疏泄不利，氣滯血瘀，甚至血敗肉腐，陰陽離絕。柴黃清胰活血方由生大黃、柴胡、黃芩等14味中藥組成，具有清熱解毒、通腑泄?jié)帷⑹韪卫?、活血化瘀、緩急止痛之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，大黃具有抗炎、改善微循環(huán)、清除內(nèi)毒素、促進(jìn)腸蠕動(dòng)等藥理活性，能有效減輕膽汁及胰液淤積，降低SAP大鼠血清ALT、AST，減輕SAP并發(fā)肝損傷[13]。黃芩的主要成分為黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等作用，可下調(diào)SAP 患者NF-κB 活性和炎癥因子IL-6 水平，使AMY、ALT 下降，減輕胰腺、肝臟組織損傷[4，8]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷可調(diào)控NF-κB/STAT3 信號(hào)通路，發(fā)揮抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫、解熱、鎮(zhèn)痛的作用，減輕小鼠肝損傷程度[14]；且可提高GSH 等抗氧化水平，降低MDA活性及其引起的交聯(lián)性損傷[15]。

4 結(jié)論

SAP 并發(fā)肝損傷是一個(gè)多因素、多方面且復(fù)雜的病理生理過程。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究中已證實(shí)柴黃清胰活血方對(duì)SAP模型大鼠具有治療作用[16-18]，本研究進(jìn)一步探討其對(duì)肝損傷氧化應(yīng)激作用機(jī)理，結(jié)果顯示給予柴黃清胰活血方干預(yù)可通過誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)的上調(diào)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)（降低MDA 水平），有效提高機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力（升高SOD、CAT、GSH-Px 活性），從而降低肝損傷相關(guān)標(biāo)志物（ALT、AST）的表達(dá)，減輕SAP 模型大鼠肝臟組織病理損傷程度。但本方藥味的藥理及化學(xué)成分復(fù)雜，難以解釋發(fā)揮療效的可能靶點(diǎn)和信號(hào)通路，今后可根據(jù)中藥多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和闡釋組方藥對(duì)關(guān)系及作用機(jī)制，并進(jìn)行深入臨床研究，以更好地掌握SAP 并發(fā)肝損傷的發(fā)病機(jī)制，為該病的防治和新藥的研究提供新的理論和實(shí)踐依據(jù)。