錢 乾，許 芳，李 敏，李建光

（新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

黑色素瘤是一種具有極強侵襲轉移能力的黑色素細胞惡性腫瘤，常起源于皮膚色素沉著部，由位于皮膚表皮層的神經嵴黑色素細胞調控異常增殖形成[1]。惡性程度高，侵襲性強，易發(fā)生血液及淋巴轉移，約80%的皮膚癌患者死于黑色素瘤，是死亡率最高的皮膚癌類型[2]。我國黑色素瘤的發(fā)病率為0.49/10萬，占腫瘤患者的2%[3]。近年來，多種腫瘤的發(fā)病增長率開始下降，但黑色素瘤仍以每年3%的趨勢增長且呈年輕化趨勢[4]。目前常規(guī)的放射、化學藥物、靶向藥物以及免疫治療藥物等治療方法，存在不良反應明顯、單靶點易產生耐藥等諸多問題[5]。乙酰紫草素是從新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnst.]根中提取的一種萘醌類活性產物[6]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[7-9]。紫草素通過激活ROS、線粒體途徑以及JNK信號通路等誘導腫瘤細胞的凋亡[10,11]。乙酰紫草素作為紫草素的一種衍生物，其對黑色素瘤A375細胞的作用目前鮮有研究報道。本研究通過體外培養(yǎng)黑色素瘤A375細胞，采用CCK-8法，形態(tài)學分析，流式細胞術以及Western blot法，探究乙酰紫草素對人黑色素瘤A375細胞增殖與凋亡的影響，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo scientific公司），全自動酶標儀（美國Thermo scientific公司），冷凍離心機（美國Sigma公司），流式細胞儀（美國BD公司），倒置顯微鏡（中國麥克迪奧公司），熒光顯微鏡（中國麥克迪奧公司），電泳轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）。

1.2 試藥乙酰紫草素（新疆醫(yī)科大學實驗室自制，含量＞98%），DMED高糖培養(yǎng)基（以色列BI公司，批號：20203012），胎牛血清（以色列BI公司，批號：2021013），雙抗（以色列BI公司，批號：20205003），0.25%胰蛋白酶（以色列BI公司，批號：20205026），PBS緩沖液（以色列BI公司，批號：20211028），DMSO（美國Sigma公司，批號：WXBC7821V），CCK-8試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：BJ05203090），ECL化學發(fā)光試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：BJ07105260），二抗辣根過氧化酶標記及山羊抗鼠（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AL10187693），Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：0027279），Hoechst33342染色試劑盒（北京Solarbio公司，批號：20191113），細胞裂解液RIPA（北京Solarbio公司，批號：20191206），蛋白酶抑制劑（北京Solarbio公司，批號：20191206），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京Solar?bio公司，批號：20201017），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京Solarbio公司，批號：20200711），一抗β-肌動蛋白（β-Actin，美國Cell Signaling Technology公司，批號：20170314），一抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（Caspase-9，美國Cell Signaling Technology公司，批號：20170204），二抗辣根過氧化酶標記山羊抗兔（美國Cell Signaling Technology公司，批號：20170226），一抗Bax（英國Abcam公司，批號：GR3253667-5），一抗Bcl-2（英國Abcam公司，批號：GR3527453-2）。

1.3 細胞人黑色素瘤A375細胞（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號：20190715）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)將人黑色素瘤A375細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁鋪滿培養(yǎng)皿70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 乙酰紫草素培養(yǎng)液配制稱取乙酰紫草素2.15 mg，溶于1.303 mL DMSO中，制成5 mmol/L儲備液，于-20℃冰箱保存。后續(xù)實驗時用培養(yǎng)基稀釋至各實驗濃度（各實驗組DMSO終體積分數≤0.1%）。

2.3 CCK-8法檢測乙酰紫草素對A375細胞增殖的抑制作用取對數生長期的A375細胞，用胰酶消化后制成單細胞懸液，以2×103個/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。實驗設對照組（細胞中加入5%FBS的培養(yǎng)基）、空白組（無細胞，孔內加入5%FBS的培養(yǎng)基）以及乙酰紫草素不同濃度組（18.75、37.5、75、150、300、600、1 200、2 400 nmol/L），每組設置5個復孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10μL，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀于450 nm處測定吸光度（A）。以對照組細胞的吸光度（A）的均值作為100%活細胞數目，即對照組相對生長抑制率為零。根據公式計算：細胞相對生長抑制率（%）=（A對照組-A實驗組）/（A對照組-A空白組）×100%。

2.4 乙酰紫草素對A375細胞形態(tài)的影響取對數生長期的A375細胞以1×105個/mL的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。實驗分為對照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察并記錄細胞形態(tài)。

2.5 Hoechst 33342熒光染色法觀察乙酰紫草素對A375細胞核的影響取對數生長期的A375細胞以1×105個/mL的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。實驗分為對照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL Hoechst 33342染色液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，棄去染色液，用PBS洗滌2次，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.6 流式細胞儀檢測乙酰紫草素對A375細胞凋亡的影響取對數生長期的A375細胞以1×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。實驗分為對照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用預冷的PBS重懸并洗滌細胞2次。按照Annexin V-FITC試劑盒說明書向管中加入Annexin V-FITC染色液5μL，混勻后加入PI染色液5μL，混勻，室溫避光孵育15 min，于1 h內采用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡情況。凋亡率/%=早期凋亡率/%+晚期凋亡率/%。

2.7 Western blot檢測A375細胞中凋亡相關蛋白的表達取對數生長期的A375細胞以1×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，使細胞貼壁。實驗分為對照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用預冷PBS清洗3次，每孔加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液100μL，冰浴30 min，用細胞刮刀刮下細胞，以4℃12 000 r/min離心20 min，收集上清液于新的1 mL離心管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白含量測定。在8%～12%的SDS-PAGE凝膠上，每孔加入20～30μg蛋白樣品，80～120 V電泳分離蛋白；300 mA轉印1 h至NC膜上；用TBST溶解的質量分數為5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h，于4℃一抗孵育過夜后，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次后，用ECL發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白條帶，用Im?age J對蛋白條帶進行定量分析。

2.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩兩比較當方差齊時采用t檢驗法，方差不齊時采用Games-Howell法。三組或三組以上組間均值的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 乙酰紫草素對A375細胞增殖的抑制作用不同濃度乙酰紫草素分別作用A375細胞24、48、72 h后，乙酰紫草素濃度在20～2 400 nmol/L對A375細胞增殖具有抑制作用，見圖1。乙酰紫草素作用A375細 胞24、48和72 h的IC50分 別為(837.94±17.26)、(340.07±39.63)、(156.47±24.72)nmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 不同濃度乙酰紫草素分別在24、48、72 h對A375細胞增殖的抑制作用

3.2 不同劑量乙酰紫草素對A375細胞形態(tài)的影響

A375細胞經不同濃度（0、400、800、1 600 nmol/L）乙酰紫草素處理48 h后，細胞形態(tài)發(fā)生變化：對照組細胞生長情況較好，貼壁較牢固，細胞間緊密相連，形態(tài)呈規(guī)則的長梭狀，具有豐富的胞漿，少數細胞呈多角形;隨著乙酰紫草素濃度增加，貼壁細胞數目明顯減少，由長梭形變?yōu)榇笮「鳟惖牟灰?guī)則形，懸浮細胞逐漸增多，細胞變圓，脫落，出現皺縮和空泡，且細胞周圍有凋亡小體形成，呈現出明顯的凋亡特征，見圖2。

圖2 不同濃度乙酰紫草素對A375細胞形態(tài)變化

3.3 不同劑量乙酰紫草素對A375細胞核凋亡形態(tài)學的改變Hoechst 33342熒光染色顯示，對照組細胞核輪廓清晰可見，小核及染色質濃縮現象不明顯，呈弱藍色，乙酰紫草素處理組細胞核染色呈明顯的亮藍色，隨著乙酰紫草素的濃度增大，凋亡細胞的亮藍色熒光明顯增強，染色質濃縮現象加重。其中，在最高濃度1 600 nmol/L時，是由于細胞在發(fā)生凋亡時，細胞貼壁能力下降，細胞數量明顯減少，熒光強度最為明顯，見圖3。

3.4 不同劑量乙酰紫草素對A375細胞凋亡的影響

對照組的A375細胞凋亡率為(7.4±1.1)%，乙酰紫草素低、中、高劑量組的A375細胞凋亡率分別為(8.2±0.7)%、(16.1±1.0)%、(47.5±0.5)%，見圖4、5。

圖3 不同濃度乙酰紫草素對A375細胞核形態(tài)變化

3.5 不同劑量乙酰紫草素對A375細胞中凋亡相關蛋白表達的影響與對照組比較，乙酰紫草素低、中、高劑量組A375細胞中Bax與Cleaved caspase-9表達上調，Bcl-2表達下調，Bax/Bcl-2顯著增加（P＜0.05），Cleaved caspase-9/β-Actin顯著增加（P＜0.05）。提示乙酰紫草素促進Bax與Cleaved caspase-9的表達，抑制Bcl-2的表達，促進細胞凋亡，見圖6～8。

圖4 流式細胞術檢測乙酰紫草素干預A375細胞凋亡的作用

圖5 乙酰紫草素對A375細胞凋亡率的影響

圖6 Western blot檢測A375細胞中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-9的表達

圖7 乙酰紫草素對A375細胞中Bax/Bcl-2表達的影響

圖8 乙酰紫草素對A375細胞中Cleaved caspase-9表達的影響

4 討論

我國擁有豐富的中醫(yī)藥資源，中藥種類繁多，在抗腫瘤治療方面具有其獨特的優(yōu)勢。目前已有許多植物提取物已用于治療癌癥，如紫杉醇、長春新堿等。中藥紫草提取物紫草素及其衍生物能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡，如乳腺癌MCF-7細胞[12]、卵巢癌A2780細胞[13]、食管癌ECA109細胞[14]、人腦膠質瘤U251細胞[15]、人胃癌MGS-80細胞[16]等。細胞過度增殖與凋亡減少是腫瘤形成的生物學基礎，同樣也是藥物對腫瘤細胞產生療效的生物學基礎。許多化療藥物抗腫瘤的作用機理之一都是抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡。當細胞發(fā)生凋亡時，細胞體積變小，變圓，脫落，細胞膜出現發(fā)泡現象，凋亡晚期可見凋亡小體[17]。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抗凋亡和促凋亡基因。研究發(fā)現，在細胞凋亡過程中，Bax在死亡信號的作用下升高，而Bcl-2則在降低。從而促進細胞的凋亡；相反，在腫瘤細胞中，Bcl-2表達升高，Bax降低，則抑制凋亡，細胞異常增殖。Caspase-9同樣也是細胞凋亡過程中關鍵因子之一，凋亡過程一旦觸發(fā)，則會使其激活形式Cleaved caspase-9增加，后觸發(fā)級聯放大效應[18]。

本研究以人黑色素瘤A375細胞為研究對象，觀察不同濃度的乙酰紫草素對人黑色素瘤A375細胞增殖與凋亡的影響，結果表明乙酰紫草素對黑色素瘤A375細胞的增殖具有一定的抑制作用，通過凋亡形態(tài)學、流式細胞術及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-9的檢測，發(fā)現乙酰紫草素可能通過誘導黑色素瘤A375細胞的凋亡從而抑制其增殖。但本研究僅初步探討乙酰紫草素對黑色素瘤A375細胞的促凋亡作用，后續(xù)有待深入探討乙酰紫草素促進A375細胞凋亡的具體途徑及其機制，為乙酰紫草素的臨床用藥提供科學依據，為開發(fā)利用中藥資源提供實驗依據。