黃心瑜，林小龍，王健寶

乳腺癌是世界范圍內(nèi)第三常見惡性腫瘤，也是女性最常見的惡性腫瘤[1]。乳腺癌起源于導(dǎo)管或小葉內(nèi)襯的上皮細(xì)胞，是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤[2]。分子生物學(xué)及影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展使乳腺癌的早期診斷和靶向治療方法得到很大改善，但目前乳腺癌尚無有效的治療方法，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋找抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效方法，對(duì)于改善患者的臨床預(yù)后至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是具有200個(gè)以上核苷酸的非編碼RNA，大量研究證實(shí)LncRNA表達(dá)失調(diào)與癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)[4]。LncRNA ADAMTS9-AS1編碼基因位于3p14.1。有研究表明，LncRNA ADAMTS9-AS1在結(jié)直腸癌、前列腺癌中表達(dá)顯著下調(diào)，ADAMTS9-AS1通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制大腸癌細(xì)胞的生長和增殖，是潛在的診斷生物標(biāo)志物[5-6]。微小RNA-513a-5p(miR-513a-5p)編碼基因位于Xq27.3。相關(guān)研究表明，miR-513a-5p在胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，還能夠靶向抑制下游抑癌基因如p53、ZFP36等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[7-8]。Fang等[9]在體外實(shí)驗(yàn)中表明，LncRNA ADAMTS9-AS1能夠與miR-513a-5p相互作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。但二者在判斷乳腺癌臨床預(yù)后中的價(jià)值尚未完全揭示。本研究通過分析乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p的表達(dá)情況，探究二者與臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系，為臨床預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年8月—2017年8月在我院住院治療的乳腺癌患者83例為研究對(duì)象。①納入標(biāo)準(zhǔn)：乳腺癌均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷；均為初次診治，行乳腺癌根治術(shù)治療；臨床相關(guān)資料齊全，患者無精神障礙性疾病能夠配合治療及隨訪。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并乳腺良性疾病，如乳腺增生、急性乳腺炎等；伴有肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤，或具有抗腫瘤治療病史者；伴自身免疫系統(tǒng)疾病、免疫功能缺陷者。本組均為女性；年齡34～67(59.3±2.7)歲。月經(jīng)情況：絕經(jīng)前41例，絕經(jīng)后42例；病理類型：浸潤型導(dǎo)管癌62例，非浸潤型導(dǎo)管癌21例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)51例，Ⅲ級(jí)32例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ期22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有40例，無43例；腫瘤直徑：<3 cm者39例，≥3 cm者44例；三陰性乳腺癌：是25例，否58例。本研究符合赫爾辛基宣言原則，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2研究方法 實(shí)時(shí)定量PCR檢測乳腺癌及癌旁組織(距癌組織2 cm以上)的LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p表達(dá)情況。各取100 mg組織，加入Trizol裂解液，在冰上研磨，離心去除組織碎片取上清。Trizol法提取組織RNA，分光光度計(jì)測定RNA純度。按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR的總反應(yīng)體系為10 μl：cDNA 0.2 μl、2×SYBR Green Premix 5 μl、正反向引物1 μl、雙蒸水3.8 μl。程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，變性、退火和延伸共40個(gè)循環(huán)。LncRNA ADAMTS9-AS1的正向引物序列：5'-CTCAGACCACAACTCTCCACCTTG-3'，反向引物序列：5'-CAGATGCTGCCTGGCTGATGG-3'；GAPDH正向引物序列5'-GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物序列：5'-GTTGAGGTCAATGAAGGG-3'。miR-513a-5p正向引物序列：5'-TAAATTTCACCTTTCTGAGAAGG-3'，反向引物序列：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；U6正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。分別以LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p相對(duì)表達(dá)量的平均值0.601、1.721為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3觀察指標(biāo) 比較乳腺癌及癌旁組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p的表達(dá)情況，并分析二者的相關(guān)性。在線生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2(http://carolina.imis.athena-nnovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2/index-predicted)分析LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p相互作用位點(diǎn)[10]。分析LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系，分析二者表達(dá)對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響及影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)情況 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)分別為0.604±0.089、1.714±0.256，癌旁組織中分別為1.613±0.275、0.411±0.069。與癌旁組織比較，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1的表達(dá)顯著降低，而miR-513a-5p的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 乳腺癌與癌旁組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)情況

2.2乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達(dá)的相關(guān)性及相互作用位點(diǎn)預(yù)測 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.611，P<0.001)。見圖2a。在線生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2預(yù)測結(jié)果顯示，LncRNA ADAMTS9-AS1序列中第273～298位的堿基位置處含有與miR-513a-5p互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)。見圖2b。

圖2 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達(dá)的相關(guān)性及相互作用位點(diǎn)預(yù)測

2.3乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。二者表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、月經(jīng)情況、腫瘤大小、病理類型、組織學(xué)分級(jí)及是否三陰性乳腺癌無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 本研究對(duì)所有乳腺癌患者隨訪2～36(32.6±2.2)個(gè)月。隨訪過程中患者死亡16例，3年總體生存率(overall survival, OS)為80.7%(67/83)。LncRNA ADAMTS9-AS1低表達(dá)組和高表達(dá)組的3年OS分別為65.9%(27/41)、95.2%(40/42)，生存時(shí)間分別為(30.5±2.0)個(gè)月、(34.6±2.3)個(gè)月。LncRNA ADAMTS9-AS1低表達(dá)組的3年OS和生存時(shí)間均顯著低于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3a。miR-513a-5p低表達(dá)組和高表達(dá)組3年OS分別為92.5%(37/40)、69.8%(30/43)，生存時(shí)間分別為(34.9±2.5)個(gè)月、(30.8±2.2)個(gè)月。miR-513a-5p高表達(dá)組的3年OS和生存時(shí)間均顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3b。

圖3 LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達(dá)對(duì)乳腺癌患者3年總體生存率的影響

2.5影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行賦值：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、腫瘤分期(Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、LncRNA ADAMTS9-AS1(低表達(dá)=1，高表達(dá)=0)、miR-513a-5p(高表達(dá)=1，低表達(dá)=0)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1低表達(dá)、miR-513a-5p高表達(dá)、高腫瘤分期及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在腫瘤特異性死亡中居第二位，僅次于宮頸癌。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢，嚴(yán)重威脅女性身體健康[11]。目前,乳腺癌的治療包括手術(shù)、放化療、激素及靶向治療等，特別是早期篩查技術(shù)、基因檢測、靶向治療及個(gè)體化治療的發(fā)展，使乳腺癌患者的無進(jìn)展生存時(shí)間和總體生存時(shí)間得到顯著延長[12-13]。因此，研究能夠反映乳腺癌患者治療反應(yīng)預(yù)測及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)，并用于指導(dǎo)臨床決策，是乳腺癌的研究熱點(diǎn)及方向。

LncRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類表達(dá)廣泛的非編碼RNA，長度>200 nt，由于LncRNA具有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，其功能與其他非編碼RNA有所不同，細(xì)胞質(zhì)中的LncRNA主要通過吸附miRNA起作用，進(jìn)而限制miRNA分子與信使RNA 3'-非翻譯區(qū)結(jié)合的能力。目前，已有研究證明LncRNA在胃腸道腫瘤、惡性黑色素瘤、鼻咽癌、骨腫瘤等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控過程[14]。LncRNA ADAMTS9-AS1位于人類染色體3p14.1，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌基因的功能，在腫瘤細(xì)胞生長和增殖過程中起抑制作用。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，LncRNA ADAMTS9-AS1在前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化，促進(jìn)腫瘤惡性增殖，并且是潛在的腫瘤診斷生物標(biāo)志物[5,15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達(dá)顯著下調(diào)，且LncRNA ADAMTS9-AS1的表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。表明LncRNA ADAMTS9-AS1能夠作為抑癌因子，抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是LncRNA ADAMTS9-AS1能夠結(jié)合下游分子，促進(jìn)下游抑癌基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中亦證實(shí)，異位過度表達(dá)LncRNA ADAMTS9-AS1不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長和集落形成，還能降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。因此，LncRNA ADAMTS9-AS1可能是抑制乳腺癌惡性進(jìn)展的重要分子。進(jìn)一步分析乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達(dá)的臨床意義，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA ADAMTS9-AS1的低表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，也是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此檢測癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1的表達(dá)水平可能有助于判斷乳腺癌患者的臨床預(yù)后，指導(dǎo)其臨床診治。

miRNA是長度19～25 nt的RNA分子，成熟的miRNA通過結(jié)合Dicer核糖核酸內(nèi)切酶，構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控，廣泛影響多種生物學(xué)過程[17]。miR-513a-5p編碼基因位于人類X染色體上。有研究結(jié)果表明，miR-513a-5p在結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤中表達(dá)異常升高，能通過抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中miR-513a-5p的表達(dá)顯著上調(diào)，分析其原因，可能與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子如胰島素生長因子1的表達(dá)增加有關(guān)。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中胰島素生長因子1介導(dǎo)的PI3K信號(hào)通路上調(diào)了miR-513a-5p的表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，乳腺癌組織中miR-513a-5p的表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。分析其機(jī)制，可能與miR-513a-5p對(duì)抑癌基因p53的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。Lin等[21]研究報(bào)道，miR-513a-5p可以抑制p53表達(dá)和同源重組修復(fù)(HR)基因活性，miR-513a-5p/p53軸在HR修復(fù)的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的作用，miR-513a-5p可能通過靶向抑制p53的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。此外，miR-513a-5p的表達(dá)上調(diào)還能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子C的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤淋巴管的新生，以及腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移[19]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，miR-513a-5p的高表達(dá)是乳腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此miR-513a-5p的表達(dá)水平亦有助于乳腺癌患者臨床預(yù)后的判斷。

LncRNA/miRNA軸在癌癥進(jìn)展過程中的作用已被廣泛證實(shí)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，生物信息學(xué)軟件預(yù)測二者之間存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，揭示LncRNA ADAMTS9-AS1可能通過與miR-513a-5p相互作用，促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展。Fang等[9]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞中miR-513a-5p是LncRNA ADAMTS9-AS1的直接作用靶點(diǎn)，LncRNA ADAMTS9-AS1通過負(fù)向調(diào)控miR-513a-5p的功能促進(jìn)乳腺癌生長和侵襲性。但仍有一些問題有待進(jìn)一步探討，一方面是本研究的樣本例數(shù)有限，需要較大的病例對(duì)照研究證實(shí)；此外，進(jìn)行動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也能夠進(jìn)一步闡明LncRNA ADAMTS9-AS1/miR-513a-5p調(diào)控軸對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為的影響。

綜上所述，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達(dá)下調(diào)，miR-513a-5p表達(dá)上調(diào)，二者與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是預(yù)測乳腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有可能成為乳腺癌診治及預(yù)后判斷的有效指標(biāo)。