莫蓓，何佩娟，楊垂勛

1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌 330006

七氟醚麻醉的好處是患者術(shù)后蘇醒比較快、對呼吸道的作用很溫和［1］，被廣泛運用于老年麻醉。然而近年的研究顯示［2］，老年病人在接受七氟醚麻醉后更容易發(fā)生認知方面的問題，經(jīng)方柴胡加龍骨牡蠣湯常用于神經(jīng)疾病的診治中［3-4］。但柴胡加龍骨牡蠣湯是否可用于防治七氟醚麻醉導致的術(shù)后認知損害，尚無文獻報道。本研究通過觀察經(jīng)方柴胡加龍骨牡蠣湯對七氟醚所致神經(jīng)認知障礙的改善作用探討其可能機制，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

1.1.1 實驗動物 本實驗所用動物為96 只18 月齡SPF 級老年SD 大鼠，雌雄各半（長沙天勤生物技術(shù)公司，實驗動物合格證號：430047000012185），放置在屏障級標準動物飼養(yǎng)間內(nèi)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品 柴胡加龍骨牡蠣湯（漢方醫(yī)藥公司）；七氟醚（濟南仁源公司）；細胞裂解液（武漢友聯(lián)特公司）；兔抗鼠NF-κB p65 抗體（南京森貝伽公司）；羊抗兔二抗（杭州格朗瑞公司）；ELISA試劑盒（深圳子科公司）

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、建模及干預 將所有大鼠按隨機數(shù)字表法分成單純七氟醚組（S 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預處理組（B 組）、柴胡加龍骨牡蠣湯預處理對照組（BC 組）以及空白對照組（C 組），每組24 只。S 組和B 組建立七氟醚致認知損害模型，B 組以及BC 組給予柴胡加龍骨牡蠣湯干預，C 組對照。步驟：S 組接受麻醉前1 周，每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進行灌胃一次，持續(xù)14 d，此后連續(xù)3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h；B 組麻醉前14 d 每日持續(xù)給予1 mL/100 g 的柴胡加龍骨牡蠣湯懸濁液灌胃（按體表面積折算動物給藥劑量），此后連續(xù)3 d 吸入2.6%七氟醚+2 L/min 氧氣2 h。BC 組接受與B 組相同的預處理，此后連續(xù)3 d 吸入空氣2 h。C 組術(shù)前每天采用1 mL/100 g 的生理鹽水進行灌胃一次，持續(xù)14 d，此后3 d 每日吸入空氣2 h。

1.2.2 Morris 水迷宮觀察大鼠空間學習記憶能力 將大鼠面向圓形桶壁依次從4 個象限入水，放一隱藏平臺，記錄逃避潛伏期。結(jié)束后2 h，撤去平臺，大鼠游泳120 s，記錄跨臺次數(shù)。

1.2.3 TUNEL 法觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量 每組選8 只大鼠，取大鼠腦組織，按照TUNEL 試劑盒說明書操作。顯微鏡觀察神經(jīng)元數(shù)量。

1.2.4 ELISA法檢測炎癥因子表達 每組選8只大鼠，取大鼠腦組織，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測炎癥因子表達。

1.2.5 Western blotting 觀察NF-κB p65 表達 用細胞裂解液提取海馬組織蛋白，BCA 法蛋白定量；取50 μg 蛋白在SDS-PAGE 上電泳，NF-κB p65 蛋白抗體，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗，常溫孵育l h 曝光成像。β-actin 作內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空間學習記憶能力

1～4 d 時，S 組大鼠的逃避潛伏期比C 組長（P＜0.05），B 組大鼠逃避潛伏期比S 組短（P＜0.05）。S 組大鼠跨臺次數(shù)比C 組多（P＜0.05），B 組大鼠跨臺次數(shù)比S 組少（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺次數(shù)（）

表1 大鼠逃避潛伏期以及跨臺次數(shù)（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元計數(shù)

S 組神經(jīng)元數(shù)量比C 組少（P＜0.05）。B 組海馬神經(jīng)元數(shù)量比S 組多（P＜0.05）。BC 組與C 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量（）

表2 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織中炎癥相關(guān)因子

表3 結(jié)果，S 組炎癥因子水平比C 組高（P＜0.05）。B 組炎癥因子水平比S 組低（P＜0.05）。BC 組與C組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達（）

表3 大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表達（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

2.4 各組大鼠NF-κB p65 的表達

表4、圖1 結(jié)果，S 組NF-κB p65 表達比C 組高（P＜0.05）。B 組大鼠NF-κB p65 表達比S 組高（P＜0.05）。BC組與C組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 大鼠NF-κB p65表達（）

表4 大鼠NF-κB p65表達（）

注：與C組比：aP＜0.05；與S組比：bP＜0.05。

圖1 大鼠NF-κB p65表達（PAGE電泳圖）

3 討論

七氟醚麻醉可能會引發(fā)老年病人出現(xiàn)認知功能障礙［5］。海馬是存在于大腦組織一個部分，目前大量關(guān)于認知的研究亦集中于海馬［6-7］。本研究結(jié)果，接受七氟醚麻醉的大鼠逃避潛伏期變長，跨臺次數(shù)變少，這提示在七氟醚麻醉后大鼠的認知的確有障礙，同時，大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量也在減少，說明七氟醚對大鼠的海馬結(jié)構(gòu)亦產(chǎn)生了不利的影響。

老年人在受到應激、創(chuàng)傷、麻醉等過程后會誘發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應，導致NF-κB 通路的活化，進一步加劇中樞和外周炎癥因子表達，以此來損傷神經(jīng)元細胞，從而造成認知功能障礙［8-9］。在本研究中，NF-κB 通路被激活，NF-κB p65 表達增多，七氟醚麻醉的老年大鼠腦中IL-1β、IL-6 和TNF-α 顯著高于正常大鼠，提示七氟醚麻醉加劇神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥反應。

柴胡加龍骨牡蠣湯是一種傳統(tǒng)中藥方劑，能夠?qū)窦膊∮泻芎玫木徑庾饔茫?］。動物實驗也顯示［10］，柴胡加龍骨牡蠣湯也能改善阿爾茨海默病模型大鼠的精神狀態(tài)。本實驗結(jié)果與之相似，在經(jīng)過此方干預后，大鼠認知明顯改善，同時，NF-κB p65 表達下調(diào)，炎癥因子的水平隨之降低，神經(jīng)元數(shù)上調(diào)，提示柴胡加龍骨牡蠣湯會阻礙NF-κB p65的表達，抑制炎癥因子表達，進而減輕對神經(jīng)元細胞的傷害而發(fā)揮作用。另外對正常大鼠使用此方并不會影響大鼠機體各項指標，提示其安全性也比較可靠。