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        酶聯(lián)免疫法測量動物尿液中萊克多巴胺含量的不確定度分析

        2021-06-23 00:57:12盧壽康胡鳳霞葉惠儀邱詩婷
        畜牧業(yè)環(huán)境 2021年10期
        關(guān)鍵詞:測量標(biāo)準(zhǔn)

        盧壽康,胡鳳霞,葉惠儀,邱詩婷

        (廣東省東莞市萬江農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,廣東東莞 523000)

        1 前言

        酶聯(lián)免疫法(ELISA)是應(yīng)用在動物尿液、組織或飼料中的萊克多巴胺(瘦肉精)檢測的一種快速篩選方式,隨著近年來萊克多巴胺酶聯(lián)免疫法試劑盒質(zhì)量的提高,能夠定量或半定量測定樣品中萊克多巴胺含量。測量不確定度示表征測量值所處量值范圍內(nèi)的參數(shù),可以反映數(shù)據(jù)的不確定程度以及可信程度[1-2],是與現(xiàn)有可利用知識相應(yīng)的最佳值接近程度的一種估計。迪恩生物有限公司提供的質(zhì)檢報告,校正曲線在0~8.1ng/mL范圍內(nèi)精密度為CV為0.36%~5.37%。雖然該方法為萊克多巴胺的篩選方法,但鑒于能夠定量或半定量測定,研究者認(rèn)為該方法測量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響因素有做合理分析的必要性,應(yīng)該分析尋找主要影響因素并算出其所測結(jié)果的不確定度來對所測結(jié)果做準(zhǔn)確可靠性評估。

        萊克多巴胺是動物性食品中常有的激素類添加劑,近幾年我國進出口岸對入境口岸食品中的檢測多次測出萊克多巴胺。正常劑量的瘦肉精藥物進入動物體內(nèi)后可以通過新陳代謝排出,但過量攝入后該激素類添加劑用于動物飼料中后在動物體內(nèi)會有大部分激素殘留,不僅對動物機體有負面影響,對消費者的身體健康也有很大危害。

        2 方法

        2.1 試驗方法

        將萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒在22℃~25℃放置1h以上。豬尿樣以3000rmp/min的速度離心3min。向萊克多巴胺微孔板中加入50μL系列標(biāo)準(zhǔn)/豬尿樣品,立即向所有孔中加入100μL酶標(biāo)工作液,輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘,在22℃~25℃孵育10min,倒出微孔中的液體。將所有微孔放入洗板機中洗板4次,每次每孔用250μL清洗液。將微孔板倒置在吸水紙上,拍干或用脫水儀脫水,加入100μL顯色劑,搖勻反應(yīng)板,22℃~25℃顯色10min,最后加入100μL終止液。10min內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm波長下測量吸光度值。

        2.2 測定結(jié)果數(shù)學(xué)模型

        式中:B為樣品在450nm下的吸光度;

        B0為零標(biāo)準(zhǔn)在450nm的吸光度;

        x為樣品中萊克多巴胺的濃度,μg/L;

        a,b為線性曲線的擬合系數(shù)。

        3 不確定度的來源分析

        用魚骨圖表示如下:

        3.1 移液器加樣引起的不確定度u(fv)

        a.加入50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液/樣品的不確定度;b.加入100μL酶標(biāo)工作液的不確定度;c.溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度;B類評定,按均勻分布。

        3.2 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度u(c)

        在0~8.1ng/mL范圍內(nèi)精密度為CV為0.36%~5.37%。包括廠家配液時使用的移液器、溶液溫度變化,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最大允許差所引起的不確定度;B類評定,按均勻分布。

        3.3 試劑回收率引起的不確定度u(Rec)

        通過迪恩生物有限公司樣品檢測限及回收率實驗(說明書介紹有數(shù)據(jù))或本實驗室進行樣品檢測限及回收率實驗求得回收率;B類評定,按均勻分布。

        3.4 酶標(biāo)儀測定OD值u(f(A))產(chǎn)生的不確定度

        依照校準(zhǔn)證書,酶標(biāo)儀在450nm測定范圍0.220-1.342A時,儀器的誤差分別為0.001、0.000A、-0.003A、0.000A;校準(zhǔn)證書上顯示的測量結(jié)果的擴展不確定度U=0.02,k=2。

        3.5 樣品重復(fù)測量的不確定度u(RSD)

        使用3個梯度的加標(biāo)樣品和1份豬尿樣品分別進行重復(fù)測量8次,A類評定,通過貝塞爾公式計算。

        3.6 吸光度與濃度轉(zhuǎn)換引入的不確定度u(f(x))

        經(jīng)迪恩生物有限公司ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)作出“相對吸光度——濃度對數(shù)”擬合曲線,求得擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD值),A類評定,通過最小二乘法計算。

        4 不確定度分量的量化

        4.1 移液器加樣造成的不確定度u(fv)

        4.1.1 移液器容量誤差產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)。查JJG646-2006《移液器檢定規(guī)程》可調(diào)式移液器在50μL檢定點的容量允許誤差為±3%,按均勻分布計算,U(P50)在100μL檢定點的容量允許誤差為按均勻分布計算,

        4.1.2 溫度效應(yīng)造成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(T)。按規(guī)定容量器皿的校準(zhǔn)在20℃下進行,水的膨脹系數(shù)為 2.1×10-4/℃,假設(shè)實驗室的溫度在 23.5±1.5℃之間波動。由于溶液在不同溫度下,密度不一樣,體積也發(fā)生變化,根據(jù)溶液的種類及濃度從校正表中查出23.5℃水的補正值A(chǔ),實際體積

        按均勻分布,加樣為49.9655μL、99.931μL由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

        4.1.3 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度由于u(P)和u(T)相互獨立,故

        整個實驗過程中分別有樣品50μL、酶標(biāo)工作液100μL、顯色劑100μL和終止液100μL四步加樣步驟,四者分別是相互獨立的關(guān)系。

        4.2 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度u(c)

        杭州迪恩生物有限公司提供的質(zhì)檢報告給出的標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0~8.1ng/mL范圍內(nèi)精密度(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)CV為0.36%~5.37%),則u(c)=5.37%=0.0537。

        4.3 試劑回收率u(Rec)引起的不確定度

        浙江迪恩生物科技股份有限公司的提供的說明書,尿液樣品該試劑盒的回收率為90±20%,按均勻分布。則u

        4.4 酶標(biāo)儀測定OD值u(f(A))引起的不確定度

        MULTISKANFC酶標(biāo)儀在450nm的吸光度示值的最大允差為±0.03A,校準(zhǔn)證書上顯示的測量結(jié)果的擴展不確定度

        4.5 樣品重復(fù)測量的不確定度u(RSD)

        使用3個梯度(1.1ppb、2.2ppb、5.5ppb)的加標(biāo)樣品和1份豬尿樣品分別進行重復(fù)測量8次,并剔除認(rèn)為無效的數(shù)據(jù)[6]。表1數(shù)據(jù)顯示,4個樣品測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不大于15.1%。鑒于日常檢測中同一樣品做兩次平行測量,以2次測量的平均值作為被測量的估計值,

        表1 樣品重復(fù)性測量結(jié)果

        4.6 吸光度與濃度轉(zhuǎn)換u(f(x))引入的不確定度

        使用杭州迪恩生物有限公司提供的ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),通過對6組試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測量2次,測得的吸光值,將所有標(biāo)準(zhǔn)品的B/B0在半對數(shù)系統(tǒng)里依次輸入,根據(jù)每個標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的不同濃度,可以得出圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品的B/B0值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中能找到對應(yīng)的萊克多巴胺的濃度。通過分析得到萊克多巴胺的線性回歸方程,表示為Y=-0.1507X+0.4938,其中,斜率為-0.1507,截距為0.4938,相關(guān)系數(shù)|R|=0.9934,具有良好的線性相關(guān)性[7]。經(jīng)ELISA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)通過最小二乘法求得曲線的SD值為0.13,

        5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

        不確定度分量列表于下:

        萊克多巴胺相對合成不確定度:

        當(dāng)樣品中萊克多巴胺的濃度x為0.2123μg/L時,Ux=urel×x=0.1920×0.2123=0.0408μg/L

        6 擴展不確定度

        按照慣例,取擴展因子k=2,則擴展不確定度為Uk=Ux×k=0.0408μg/L×2=0.0816μg/L

        7 結(jié)果報告

        按照農(nóng)業(yè)部1025公告-6-2008《動物性食品中萊克多巴胺殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附法》,測定豬尿中萊克多巴胺的平均含量0.2123μg/L,Uk=0.0816μg/L,k=2。

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