冉小柯，陳欣菊，趙云霞，張 鑫，楊 荷，孫祎堯，陳曉琦

1 河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化科，鄭州 450000

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和病死率均較高，是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因[1-2]，其中肝細(xì)胞癌(HCC)約占90%[3]。手術(shù)切除、介入、靶向藥物等是目前肝癌治療的常見手段[4-6]，這些傳統(tǒng)的治療方法雖然能夠取得一定療效，但仍然不能有效降低肝癌病死率。因此，探討肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，篩選新的治療方法及靶點，是目前肝癌研究的一個主要方向，對于提高肝癌患者總體預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義及臨床應(yīng)用價值。叉頭(forkhead box，F(xiàn)OX)轉(zhuǎn)錄因子家族是進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其成員是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)的DNA結(jié)合蛋白，大多數(shù)成員與癌癥有關(guān)，F(xiàn)OX家族基因通過基因擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄病毒整合、染色體易位和轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與致癌作用[7-9]，因此，F(xiàn)OX轉(zhuǎn)錄因子可作為預(yù)測和治療的直接或間接靶標(biāo)，成為新型的監(jiān)測標(biāo)志物[10]。其中，F(xiàn)OXA2與FOXJ2是主要發(fā)揮抑癌作用的轉(zhuǎn)錄激活因子[11-12]。本研究通過免疫組化方法檢測FOXA2、FOXJ2在HCC中的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月—2019年7月于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)或穿刺術(shù)的原發(fā)性肝癌患者54例，其中男44例，女10例，年齡29～78歲，中位年齡56歲，平均(54.85±1.52)歲。所有患者病理學(xué)檢查證實為HCC，臨床病理資料完整，均有乙型肝炎病史，未行放療、化療、生物治療等相關(guān)治療。參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[1]進(jìn)行分期，Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期11例。

1.2 試劑 免疫組化所需FOXA2抗體、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；FOXJ2抗體購自蘇州百遠(yuǎn)生物科技有限公司；鼠/兔通用二抗(PV-9000)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟組織切片需二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度酒精水化，使用高壓蒸汽鍋進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，室溫下濕盒孵育，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶孵育10 min，PBS沖洗3次，F(xiàn)OXA2、FOXJ2抗體均按照1∶100稀釋，滴加一抗后37 °C保溫箱孵育60 min，PBS沖洗3次，滴加適量反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，室溫孵育二抗20 min，PBS沖洗3次，加入新鮮配置的DAB 顯色液，室溫孵育5 min，蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。

1.4 結(jié)果判定 FOXA2、FOXJ2免疫組化染色以出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為其陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)OXA2主要以細(xì)胞核染色為主，F(xiàn)OXJ2細(xì)胞核及胞質(zhì)均染色。所有切片均由本院2名病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行觀察，每張切片隨機(jī)觀察計數(shù)5個高倍鏡視野下陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度、細(xì)胞陽性率和半定量分析進(jìn)行判定。高倍鏡下隨機(jī)選取10個高倍視野(×400)，以陽性細(xì)胞所占的百分比聯(lián)合細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[13]如下：“-”不表達(dá)，計0分，“+”為低表達(dá)，計1 ～3分，“++”為中度表達(dá)，計4～6分，“+++”為高表達(dá)，計7～9分；0分為陰性，1～9分為陽性。

1.5 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核，批號：2018HL-079-01。本研究中樣本信息對外提供或開放使用已在中國人類遺傳資源信息辦公室備案，備案號：2021BAT0182。所有患者均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 FOXA2、FOXJ2在HCC組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

FOXA2在HCC組織呈彌漫性胞核表達(dá)，F(xiàn)OXJ2呈彌漫性胞核及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，染色均呈棕黃色或棕褐色。54例HCC組織中，F(xiàn)OXA2陽性表達(dá)38例，陽性表達(dá)率約為70.37%(圖1)；FOXJ2陽性表達(dá)41例，陽性表達(dá)率約為75.92%(圖2)，二者半定量分析均值見表1。HCC組織中FOXA2和FOXJ2表達(dá)水平均不服從正態(tài)分布，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，rs=0.648，P<0.001，提示FOXA2與FOXJ2表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)。

注：a, FOXA2在HCC組織中不表達(dá)；b, FOXA2在HCC組織中低表達(dá)；c, FOXA2在HCC組織中中度表達(dá)；d, FOXA2在HCC組織中高表達(dá)。

表1 FOXA2、FOXJ2表達(dá)的半定量分析

注：a, FOXJ2在HCC組織中不表達(dá)；b, FOXJ2在HCC組織中低表達(dá)；c, FOXJ2在HCC組織中中度表達(dá)；d, FOXJ2在HCC組織中高表達(dá)。

2.2 HCC組織中FOXA2、FOXJ2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 FOXA2陽性組與陰性組間腫瘤直徑、分化程度、腫瘤個數(shù)、AFP水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；FOXJ2陽性組與陰性組間分化程度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

采用Wilcoxon秩和檢驗對與FOXA2和FOXJ2表達(dá)水平相關(guān)的病理特征組間差異進(jìn)行比較，結(jié)果提示，F(xiàn)OXA2：腫瘤直徑大小(Z=-0.518，P=0.604)、AFP表達(dá)水平高低(Z=-1.386，P=0.166)組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，分化程度高低(Z=-2.413，P=0.016)、腫瘤個數(shù)多少(Z=-2.113，P=0.035)組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；FOXJ2:分化程度高低(Z=-3.423，P=0.001)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 HCC組織中FOXA2、FOXJ2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 對54例HCC患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA2、FOXJ2陽性表達(dá)組HCC患者的累積生存率均顯著高于FOXA2、FOXJ2陰性表達(dá)組HCC患者(P值均<0.01)(圖3、4)。

圖3 FOXA2陽性表達(dá)及陰性表達(dá)HCC患者的生存曲線

圖4 FOXJ2陽性表達(dá)及陰性表達(dá)HCC患者的生存曲線

3 討論

HCC治療后復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差，盡管新型藥品及醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步使患者生存狀況較前改善，但仍然無法滿足治療需要[4-6]。目前癌癥的研究主要集中在人類癌癥分子靶向相關(guān)治療策略的開發(fā)上[14]。過去10年中，分子細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)展進(jìn)一步闡明了癌癥生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并促進(jìn)了分子靶向藥物的開發(fā)[15]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控最常見的方式之一，轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合特定的 DNA 序列來控制從 DNA 到信使 RNA 的遺傳信息轉(zhuǎn)錄速率，轉(zhuǎn)錄多種因素包括引發(fā)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的多種蛋白質(zhì)[16-17]。FOX家族是進(jìn)化上保守的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其特點在于獨特的DNA結(jié)合叉頭結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)OX 結(jié)構(gòu)域是一個約有 100 個氨基酸的單體 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在生物過程中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、代謝、增殖、凋亡、遷移、侵襲以及胚胎發(fā)生、發(fā)育和壽命等多種作用[9,18]。FOX 家族基因作為癌基因或腫瘤抑制基因參與癌癥的發(fā)生及發(fā)展[7-8]，不同的亞家族其作用機(jī)制不同[19]。人類癌癥的全基因組測序數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，將揭開FOX家族基因本身及其FOX結(jié)合位點在腫瘤細(xì)胞上的突變情況，最終將應(yīng)用于臨床上癌癥的診斷、治療及預(yù)后評估[20]。

表2 FOXA2、FOXJ2的表達(dá)與肝癌相關(guān)臨床病理特征的關(guān)系

FOXA2又被稱為肝細(xì)胞核因子3-β，是與肝特異性白蛋白相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，F(xiàn)OXA2與染色質(zhì)相互作用，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與機(jī)體的生長發(fā)育及能量代謝[21-23]。同時，F(xiàn)OXA2 也是肝臟發(fā)育的先驅(qū)因子，具有調(diào)節(jié)肝臟發(fā)育和代謝平衡的作用[24-25]。近年來，有多篇文獻(xiàn)[26-30]報道FOXA2具有抑癌作用，在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞中均呈下調(diào)趨勢，其表達(dá)水平與癌癥惡性程度呈負(fù)相關(guān)。Wang等[31]對比肝癌組織與癌旁組織中FOXA2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXA2在癌組織中的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)OXA2 通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而抑制HCC的侵襲性和轉(zhuǎn)移，并影響了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。FOXA2的高表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的能力，F(xiàn)OXA2可能成為治療HCC的新靶點[32]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA2的表達(dá)水平與TNM分期、癌栓形成、是否轉(zhuǎn)移均無關(guān)，這一結(jié)論有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究；FOXA2的表達(dá)水平與腫瘤直徑、分化程度、腫瘤個數(shù)、AFP相關(guān)，并且與分化程度高低、腫瘤個數(shù)多少相關(guān)；FOXA2陽性表達(dá)組HCC患者的生存時間顯著高于FOXA2陰性表達(dá)組，提示FOXA2的表達(dá)水平與HCC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，可能是影響肝癌預(yù)后的重要基因。

FOXJ2是雙序列特異性結(jié)合DNA，有FHX.L和FHX.S(由位于人類染色體上的單個基因編碼)2種同工型[33]，其重要性最近被廣泛關(guān)注[34]。FOXJ2目前定位于細(xì)胞核中，并且可能參與所有FOX因子的核易位機(jī)制[35]，在參與人類早期胚胎發(fā)育等諸多過程中發(fā)揮重要作用，與調(diào)控細(xì)胞的生長及代謝以及細(xì)胞多種生物學(xué)特性關(guān)系密切[36]。研究[13,37-39]證實，F(xiàn)OXJ2可抑制鼻咽癌、腦膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平在腫瘤組織中下調(diào)，且表達(dá)水平降低與腫瘤患者預(yù)后不良呈正相關(guān)。FOXJ2也可能是肝癌預(yù)后的重要因素，Zhang等[40]通過免疫印跡法和免疫組織化學(xué)分析表明，F(xiàn)OXJ2 在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中均下調(diào)，并且觀察到 FOXJ2 表達(dá)水平與肝癌之間呈負(fù)相關(guān)，并使用CCK-8分析法證實FOXJ2能夠有效抑制HCC的增殖。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXJ2的表達(dá)水平與HCC的分化程度及分化程度高低相關(guān)；FOXJ2陰性表達(dá)組HCC患者的生存時間顯著低于FOXJ2陽性表達(dá)組患者。由此可見，F(xiàn)OXJ2的表達(dá)水平與 HCC 的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，表明FOXJ2可能是影響HCC患者預(yù)后的重要因素。本研究未能發(fā)現(xiàn)其與TNM分期、癌栓形成、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，可能與本研究樣本量、臨床穿刺及手術(shù)患者分期較早等臨床特點相關(guān)，有待進(jìn)一步臨床、基礎(chǔ)研究探討。

靶基因聯(lián)合是目前備受關(guān)注的熱點，聯(lián)合治療可大幅度提高患者獲益率。FOXA2、FOXJ2作為FOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通過發(fā)揮抑癌作用參與癌癥的發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，重點分析FOXA2、FOXJ2 表達(dá)水平與臨床相關(guān)臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為肝癌治療提供新思路。本研究臨床數(shù)據(jù)證實，F(xiàn)OXA2和FOXJ2在HCC組織內(nèi)的表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)，表明二者對HCC的影響起協(xié)同作用，未來有望共同參與HCC的預(yù)測及治療。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：冉小柯負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；趙云霞、張鑫、楊荷、孫祎堯參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；陳曉琦、陳欣菊負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。