龍慎豪，胡 衛(wèi)，張 煒

(1.三峽大學，湖北 宜昌 443000；2.宜昌市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 宜昌 443000)

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19，以下簡稱“新冠肺炎”)給人民健康及社會穩(wěn)定均帶來了巨大的負面沖擊。急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是此次新冠肺炎患者的主要危重并發(fā)癥之一[1]，有研究發(fā)現(xiàn)重癥患者中年齡較大者有更多的潛在患病風險，從發(fā)病至發(fā)展為ARDS的時間為8.0天[2]。根據(jù)國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)的通知[3]，本病以發(fā)熱、乏力、干咳為主要臨床表現(xiàn)；少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀；重型患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙等。因此，能否針對ARDS形成快速有效治療，決定著是否能有效截斷病程，進而起到降低新冠肺炎患者死亡率的作用。

中醫(yī)藥在此次治療新冠肺炎方面顯示出了確切療效，不但能改善普通患者臨床癥狀、 縮短病程，還能防止重癥、危重癥患者的病情惡化[4]。從2020年2月6日起，國家中醫(yī)藥管理局和國家衛(wèi)生健康委聯(lián)合發(fā)文推薦全國各地使用清肺排毒湯治療新冠肺炎[5]。從使用效果來看，清肺排毒湯對治療新冠肺炎具有良好的臨床療效和救治前景，最大程度提高了治愈率、降低了病死率[6]。有研究指出清肺排毒湯的起效關鍵在于有效地針對了此次疫情屬于“寒濕疫”的特性，尤其是本方中用到了麻黃湯來宣散透邪化飲[7]。麻黃湯出自漢代張仲景所著《傷寒雜病論》，由麻黃、桂枝、杏仁、甘草4味中藥組成。麻黃湯為治療外感風寒表實證的主要方劑，具有解表散寒、宣肺平喘、利水消腫等功效。

網(wǎng)絡藥理學能從生物網(wǎng)絡平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從改善或恢復生物網(wǎng)絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發(fā)現(xiàn)。網(wǎng)絡藥理學通過對網(wǎng)絡的分析來闡明中藥復方多成分、多靶點的藥物協(xié)同作用機制，能為系統(tǒng)地理解中藥與疾病之間復雜關系提供依據(jù)[8]。本研究中，我們采用網(wǎng)絡藥理學和生物信息學方法探討麻黃湯作用于COVID-19的潛在機制。

1 方法

1.1 麻黃湯中活性成分收集與篩選

采用數(shù)據(jù)庫TCMSP(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[9]和TCM-ID(http：//www.megabionet.org/tcmid/)[10]，分別以4味藥的拼音名“mahuang”“guizhi”“xingren”“gancao”為關鍵詞檢索得到麻黃湯中含有的化合物成分。通過TCMSP平臺過濾器自定義篩選結果，選擇活性化合物的篩選條件：口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。篩選出麻黃湯中各味中藥的活性成分后，分別通過各成分的Pub Chem CId號在數(shù)據(jù)庫Pub Chem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)[11]中搜索得到各自對應的規(guī)范SMILES結構。

1.2 活性成分的潛在靶點預測

將各活性成分分子的規(guī)范SMILES結構輸入到數(shù)據(jù)庫Swiss target prediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)[12]中進行反向分子對接來預測靶點，選擇物種為“Homo sapiens”，只保留可能性大于0的靶點。最后，預測得到的所有靶點均采用Uniprot(https：//www.uniprot.org/)[13]數(shù)據(jù)庫進行基因名稱校正。

1.3 ARDS的已知治療靶點收集與篩選

疾病的已知治療靶點來自于CTD(http：//ctdbase.org/)[14]數(shù)據(jù)庫，輸入關鍵詞“ARDS”“acute respiratory distress syndrome”，得到與 ARDS相關的基因靶點，以CTD數(shù)據(jù)庫的推斷分數(shù)(Inference Score≥30) 作為篩選條件，篩選結果作為疾病的候選靶點。然后再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對所得疾病靶點進行基因名稱校正。

1.4 網(wǎng)絡構建

在上述預測靶點與疾病的已知治療靶點相互映射取交集后，將交集靶點投入到蛋白質相互作用分析平臺STRING(https：//string-db.org/)，種屬選擇“Homo sapiens”，獲取靶蛋白之間的相互作用關系，并將篩選條件設置為最高可信度“highest confidence(≥0.7)”，其余參數(shù)默認。剔除掉游離于網(wǎng)絡的靶點后，剩下的即為網(wǎng)絡核心靶點。再采用Cytoscape 3.7.1(http：//www.cytoscape.org/)[15]軟件來構建藥物-靶點-疾病復合網(wǎng)絡，對上述數(shù)據(jù)進行可視化分析。

1.5 候選靶點基因功能和通路富集分析

為了更好地說明上述所得到的網(wǎng)絡核心靶點的生物學過程(biological process)及其所涉及的信號通路情況，我們采用CTD(http：//ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫對這些靶點進行了GO富集分析及KEGG 富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05為篩選條件，并按照FDR值由小到大順序排列。

2 結果

2.1 麻黃湯活性成分篩選結果

通過檢索TCMAP和TCM-ID數(shù)據(jù)庫共得到976個化合物，其中符合篩選條件OB≥30%、DL≥0.18，且能以其SMILES結構預測靶點的化合物共有91個。在剔除掉重復項后，剩下78個唯一化合物成分，其中18個來自麻黃，7個來自桂枝，17個來自杏仁，49個來自甘草。麻黃湯中活性成分信息見表1。

表 1 麻黃湯中活性化合物

2.2 候選靶點篩選結果

先通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，利用上述活性成分的SMILES結構進行反向分子對接，剔除掉可能性為零的靶點及重復項后，共得到733個預測靶點。再通過檢索CTD數(shù)據(jù)庫，剔除掉重復項后，剩下2 837個疾病已知治療靶點。其中，復合CTD數(shù)據(jù)庫推斷分數(shù)(Inference Score≥30)篩選條件的靶點有102個。然后，將預測靶點和疾病已知治療靶點相互映射后，再將交集部分導入STRING數(shù)據(jù)庫，保留最高可信度“highest confidence(≥0.7)”的部分，得到24個候選靶點。候選靶點的基本信息見表2。

表2 麻黃湯靶點的基本信息

2.3 構建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡

以麻黃湯、藥物、24個潛在靶標及疾病ARDS作為節(jié)點，用Excel文件格式分別定義各節(jié)點及各連線的屬性和關系，通過Cytoscape 3.7.1 軟件進行數(shù)據(jù)編排和圖形處理，得到麻黃湯-藥物-靶標-疾病(ARDS)網(wǎng)絡，見圖1。該復合網(wǎng)絡共包含30個節(jié)點和86條邊，三角形節(jié)點代表方劑麻黃湯，菱形節(jié)點代表藥物，圓形節(jié)點代表藥物所作用的靶點，V形節(jié)點則代表疾病。其中，根據(jù)化合物所作用靶點的次數(shù)由小到大，圓形節(jié)點的顏色由淺到深漸變。

圖1 麻黃湯藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡

2.4 候選靶點富集分析結果

通過CTD數(shù)據(jù)庫對24個候選靶點進行GO富集分析(FDR≤0.05)，得到GO(biological process)條目809條，其中靶基因主要參與氧化應激反應、細胞對細胞因子刺激的反應、細胞對化合物刺激的反應、細胞因子介導的信號通路、細胞凋亡過程、免疫系統(tǒng)進程、炎癥反應等生物學過程，見圖2。

圖2 麻黃湯作用靶點 GO (biological process)功能分析

此外，根據(jù)通路注釋分析(FDR≤0.05)結果，共得到信號通路249條。通過分析發(fā)現(xiàn)，候選靶點主要富集在免疫系統(tǒng)、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-kappa B信號通路，與細胞凋亡、流行性感冒、基因轉錄、炎性小體等有密切聯(lián)系，見圖3。

圖3 麻黃湯作用靶點信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

本研究中，我們采用網(wǎng)絡藥理學和生物信息學方法來探究麻黃湯防治COVID-19的潛在機制。通過對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的檢索和篩選，一共鑒定出了78種符合篩選標準的生物活性成分，其中有一些活性成分為多種中藥所共有。例如β-谷甾醇(Beta-sitosterol)同屬于麻黃和桂枝；谷甾醇(Sitosterol)同屬于桂枝、杏仁和甘草；豆甾醇(Stigmasterol)同屬于麻黃和杏仁；山柰酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、柚皮素(Naringetol)同屬于麻黃和甘草；甘草黃酮(Glabridin)、丁子香萜(Mairin)、甘草甙(Liquiritin)則同屬于杏仁和甘草等。在這78種活性成分中，有一些成分已經(jīng)被研究報道過對ARDS有治療作用，例如山柰酚(Kaempferol)被發(fā)現(xiàn)能夠抑制核轉錄因子-κB(NF-kappa B)的活化從而降低促炎癥反應來實現(xiàn)治療ARDS的目的[16]；此外，甘草黃酮(Glabridin)被證實可以抑制炎癥反應，并通過抑制MAPK和ERK信號通路的活化來發(fā)揮對ARDS的治療作用[17]；一項研究表明槲皮素(Quercetin)對脂多糖誘導的肺部炎癥具有預防作用[18]；另一項研究則證實香木葉素(Diosmetin)能在一定程度上限制氧化損傷，以及限制炎癥細胞的積累和促炎細胞因子的分泌[19]。基于上述已被研究報道的事實，我們推測麻黃湯是通過其中多種活性成分協(xié)同發(fā)揮作用來治療ARDS的。

結合我們所構建的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡和蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，麻黃湯中的眾多活性成分可能是通過作用于EGFR、PTGS1、MMP2、PTGS2、MMP9、NOS2、AKT1、IL2、TNF和IL6等靶點，整體實現(xiàn)對ARDS的治療作用。其中，有一些靶點出現(xiàn)的頻次比較高，如EGFR為36種活性成分所共有，其頻次為36；PTGS1頻次為33；MMP2和PTGS2的頻次同為28等，詳見表1、圖1。這種現(xiàn)象表明麻黃湯中的多種活性成分，通過選擇性靶向多種蛋白，從而實現(xiàn)對ARDS更全面、更廣泛的治療效果。

一項臨床研究表明，COVID-19患者從入院發(fā)展至ARDS的最短時間為2天，需要經(jīng)ICU和吸氧治療，且患者體內(nèi)細胞因子風暴與疾病嚴重程度相關[20]。目前，ARDS的具體發(fā)病機制仍然模糊，但越來越多研究傾向于認同是由多種相關靶蛋白，以及這些蛋白參與的多種信號通路來共同主導調(diào)節(jié)的急性肺損傷的炎癥反應過程。ARDS的誘發(fā)因素之一為病毒引起的流行性感冒，在感染后期，病毒往往會引起肺組織上皮細胞凋亡和壞死[21-22]。從我們構建的網(wǎng)絡預測結果來看，麻黃湯主要是通過靶向IL2、IL6、AKT1、BCL2、GSK3B、MAPK1、CASP3和TNF等蛋白來干預和調(diào)節(jié)細胞的凋亡過程。有研究表明肺動脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生細胞因子如IL6、TNF等會在肺部感染期間響應病毒而招募白細胞加重炎癥損傷[23]。從網(wǎng)絡圖中還可以看到，麻黃湯能通過作用于PTGS1、PTGS2、EGFR、AKT1、IL6、RELA等靶點來調(diào)控炎癥反應，還能通過作用于NOS2、MMP2、MMP9、MPO、IL2、IL6、AKT1、BCL2等來調(diào)控免疫系統(tǒng)進程。有研究表明，免疫細胞所分泌的細胞因子如白細胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、干擾素等均參與到了ARDS的疾病進程。當有外界病原體入侵并作用于免疫細胞時，會促使免疫細胞分泌更多細胞因子，用于招募和激活更多的免疫細胞，促進形成免疫系統(tǒng)的正反饋。然而，當免疫系統(tǒng)被過度激活時，大量細胞因子會蓄積，以細胞因子風暴的形式爆發(fā)，并最終損傷機體重要器官的正常細胞，導致多器官功能衰竭[24]，這說明炎癥反應與免疫系統(tǒng)均與ARDS相關。有報道指出ARDS可加快機體分解代謝，從而消耗過多的能量引起機體營養(yǎng)不良，導致免疫功能出現(xiàn)損傷，而中藥能有效提高ARDS的免疫功能[25]。此外，研究表明中藥還可以通過調(diào)節(jié)炎性介質、抗氧化作用、調(diào)節(jié)基質金屬蛋白酶、保護內(nèi)皮功能等多種方式來治療ARDS[26]。肺泡上皮和內(nèi)皮毛細血管膜的炎癥損傷是ARDS的一個中心事件，涉及MMP2、MMP9等靶點參與調(diào)控基底膜的降解過程[27]。

從通路富集分析結果可知，麻黃湯在發(fā)揮過程中主要涉及到的通路有：TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Toll-like 受體信號通路、NF-kappa B 信號通路等，見圖3。研究發(fā)現(xiàn)ARDS時可激活PI3K-Akt 信號通路的細胞凋亡信號分子和凋亡相關的蛋白調(diào)節(jié)肺組織上皮細胞凋亡，從而顯著增加肺水腫和肺組織損傷面積[28]。同樣，也有研究表明脂多糖能通過MAPK和ERK通路誘導肺成纖維細胞核小鼠肺組織的炎癥反應[29，30]。此外，還有報道指出Toll-like 受體是一種可調(diào)節(jié)病原體識別并激活先天免疫，同時激活并放大多種組織的炎癥反應的模式識別抗體，出現(xiàn)肺損傷時Toll-like 受體信號通路中的相關分子，如 NF-κB 可明顯激活，從而增加體內(nèi)外炎性細胞因子水平[31]?；谏鲜鑫墨I研究以及我們對復合網(wǎng)絡靶點及通路的分析結果，我們推測麻黃湯主要是通過靶向多個靶點來調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應和調(diào)控內(nèi)皮細胞凋亡過程等來截斷ARDS病程，從而最終達到治療COVID-19的目的。