李敏，沈琴，王曉萍，強(qiáng)磊

(中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211198)

肝臟作為機(jī)體重要器官之一，發(fā)揮著代謝調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存和解毒作用，肝臟的免疫功能對(duì)維持組織和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。當(dāng)肝臟免疫失調(diào)時(shí)，來自外界具有危險(xiǎn)性的刺激或適當(dāng)免疫機(jī)制會(huì)導(dǎo)致病理性炎癥，機(jī)體更易受到慢性感染、自身免疫性疾病和惡性腫瘤相關(guān)的肝臟疾病的侵?jǐn)_[1]。肝臟巨噬細(xì)胞因其在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡和肝病中的重要作用受到越來越多的關(guān)注。枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KC)是肝臟駐留巨噬細(xì)胞[2]，約占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的35%，具有“哨崗”功能，在肝臟發(fā)生病變時(shí)，促炎性單核細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞(monocyte derived macrophage，MDM)并大量涌入肝臟組織，參與肝病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。自噬在肝臟中的作用已有眾多研究[5-7]，而巨噬細(xì)胞自噬在肝病中的作用是目前的研究熱點(diǎn)。與自噬在其他疾病中的作用具有兩面性不同[8-9]，巨噬細(xì)胞自噬在肝臟相關(guān)疾病中發(fā)揮的保護(hù)作用被人們視作治療肝病的潛在重要手段。

本文主要綜述了自噬的過程、自噬對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用以及巨噬細(xì)胞自噬在不同肝臟相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 自噬的過程

細(xì)胞自噬是一種機(jī)體必要的、保守的過程。在此過程中，包括可溶性蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、大分子復(fù)合物和外來異物等在內(nèi)的細(xì)胞中各種成分進(jìn)行自我降解和代謝，俗稱為“自食”(self-eat)[10]。這種細(xì)胞內(nèi)代謝過程在機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮必不可少的作用，其功能障礙參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，例如癌癥、感染性炎癥以及心血管疾病等[11-14]。細(xì)胞自噬發(fā)生過程有5步[15-17]：①自噬誘導(dǎo)：雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性被抑制，觸發(fā)自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ATG)13-ATG1/ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase)-ATG17復(fù)合物形成并啟動(dòng)自噬[18-19]；②成核：Ⅲ類磷酸肌醇3激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase，PI3K/Vps34)-ATG6/Beclin1復(fù)合物介導(dǎo)前自噬體結(jié)構(gòu)(pre-autophagosome structure，PAS)形成；③自噬體延伸：ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物在泛素活化酶E1和E2樣酶ATG7和ATG10的作用下形成，LC3/ATG8前體經(jīng)由加工修飾為L(zhǎng)C3-I和LC3-II，參與自噬體膜的延伸擴(kuò)張；④自噬體成熟[20]：自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，內(nèi)吞體分選復(fù)合物(endosomal sorting complexes required for transport(ESCRT)、Ras樣GTP酶(Ras-like GTPases，Rabs)[21]、溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein1，LAMP1)、LAMP2等參與了此過程⑤自噬體裂解。有兩種基因修飾小鼠模型可用于自噬的體內(nèi)研究：“自噬缺失小鼠”和“自噬監(jiān)測(cè)小鼠”[22]。評(píng)價(jià)自噬在體內(nèi)發(fā)揮的作用與自噬過程監(jiān)測(cè)對(duì)于更好地利用自噬診斷和治療人類疾病具有重要意義。

2 自噬在單核/巨噬細(xì)胞中的作用

在機(jī)體穩(wěn)態(tài)生理?xiàng)l件下，單核/巨噬細(xì)胞普遍存在于各種組織和體腔中，是先天免疫的重要組成部分之一，參與多種慢性炎癥和相關(guān)病理過程[23-24]。有研究表明，集落刺激因子2(colony stimulating factor 2，CSF2/GM-CSF)可激活mTOR信號(hào)通路，抑制自噬，從而促進(jìn)小鼠髓系祖細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞(見圖1)[25]；小鼠造血系統(tǒng)敲除Atg7(Atg7flox/flox;Vav-Cre)可導(dǎo)致循環(huán)外周血和組織駐留髓祖細(xì)胞數(shù)量增加[26-27]。以上結(jié)果都證明抑制自噬可以促進(jìn)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。然而，小鼠髓系敲除Atg7(Atg7flox/flox;Lyz-Cre)與野生型小鼠相比外周血并無明顯骨髓增殖，可能是由于髓系細(xì)胞僅限于粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和成熟巨噬細(xì)胞，而包括干細(xì)胞和祖細(xì)胞在內(nèi)的早期造血干細(xì)胞仍舊保持了完整的Atg7等位基因[28]。另外有研究表明自噬阻止了單核細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞[29]。可見自噬在巨噬細(xì)胞成熟分化的不同階段起到了不同的作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

圖1 自噬對(duì)骨髓來源的巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控

自噬除了與巨噬細(xì)胞的成熟分化相關(guān)外，也對(duì)其誘導(dǎo)極化具有重要意義。骨髓來源的巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)向M2型極化依賴于自噬，并由核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)自噬性降解介導(dǎo)，該過程依賴p62/SQSTM1[30-31]。Roca等[32]的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中趨化因子2(CC chemokine-2，CCL2)和白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)增強(qiáng)了自噬，促進(jìn)了人外周血來源的髓系細(xì)胞發(fā)生M2表型極化。此外，在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)的研究中發(fā)現(xiàn)，溶酶體蛋白酶組織蛋白酶S介導(dǎo)的自噬促進(jìn)TAM向M2極化，有助于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，加速腫瘤惡化[33]。然而，自噬直接調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)信號(hào)通路，還是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的降解，仍需進(jìn)一步探究。

自噬還會(huì)影響巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)的分泌和表達(dá)。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種由巨噬細(xì)胞表達(dá)的促炎性細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞Atg5被抑制后，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的MIF增多，此過程依賴于線粒體活性氧[34]。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠在受到結(jié)核桿菌感染后IL-1α、IL-12和CXC趨化因子1(C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1)都升高，但是公認(rèn)的促炎性細(xì)胞因子干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)卻沒有改變[35]?？梢姡允稍诩?xì)胞因子的產(chǎn)生過程中并非一般炎癥刺激的結(jié)果，可能與更具體的機(jī)制相關(guān)。

3 巨噬細(xì)胞自噬參與肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展

3.1 肝損傷 肝損傷發(fā)生時(shí)除了對(duì)肝細(xì)胞造成首要直接損害外，還會(huì)引起諸多免疫反應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞因子的釋放[36]。盡管KC和MDM介導(dǎo)了肝損傷后的組織重塑和修復(fù)，巨噬細(xì)胞的過度激活仍舊是形成肝細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)[1,37-38]。

內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌內(nèi)毒素重要成分，可直接或間接參與包括肝炎在內(nèi)的多種肝病的發(fā)病進(jìn)程；D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)會(huì)引起肝彌漫性壞死和肝臟炎癥，和臨床病毒性肝炎的病理性變化相似。LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性重癥肝炎常作為一種動(dòng)物模型用于研究急性肝損傷的生理、毒理機(jī)制[39-40]。有研究表明，相比野生型小鼠，LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中表現(xiàn)的更為嚴(yán)重，血清IL-1β明顯升高，阻斷IL-1β受體信號(hào)通路后肝損傷減輕，巨噬細(xì)胞自噬可通過抑制炎癥小體依賴性IL-1β的產(chǎn)生抑制LPS/GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷[41]，該自噬過程受生長(zhǎng)阻滯特異性蛋白6(growth arrest-specific protein 6，GAS6)-受體酪氨酸激酶AXL調(diào)控[41]。此外，巨噬細(xì)胞中窖蛋白(caveolin-1，Cav-1)介導(dǎo)的Notch1/HES1(hairy/enhancer of split 1)信號(hào)通路的激活對(duì)自噬的調(diào)控介導(dǎo)了超順磁性葡聚糖氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)對(duì)巨噬細(xì)胞IL-10分泌的促進(jìn)作用，抑制了炎癥，改善了LPS誘導(dǎo)的肝損傷[42]。在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)誘導(dǎo)的急性肝損傷中，KC沉默Atg5后，促炎因子分泌升高，KC向M1型極化，精胺(spermine，SPM)刺激KC自噬水平升高，抑制其M1極化，從而改善了肝損傷[43]。

酒精性肝病(alcoholic liver damage，ALD)是一個(gè)復(fù)雜的過程，酒精性肝炎是所有ALD中最嚴(yán)重的一種[44]，ALD動(dòng)物模型主要表現(xiàn)為脂肪變性和中度炎癥，而人類患者惡化為肝硬化甚至是肝衰竭才會(huì)被患者發(fā)現(xiàn)。酒精會(huì)影響自噬過程中的多個(gè)基因，干擾自噬流[45-46]。KC在慢性酒精誘導(dǎo)的早期肝損傷中起到至關(guān)重要的作用。給予小鼠KC抑制劑GdCl3可部分顯著改善肝功能，減少脂滴蓄積[47]。大麻素受體2(cannabinoid receptor 2，CBR2)對(duì)酒精誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用是通過對(duì)KC的激活調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，其通過血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)誘導(dǎo)的自噬依賴途徑抑制肝臟炎癥反應(yīng)改善肝損傷[48]，CB2激動(dòng)劑在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中對(duì)肝臟的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞自噬的必要作用。酒精喂養(yǎng)小鼠6周后，Atg7flox/flox;Lyz-Cre小鼠表現(xiàn)為更嚴(yán)重的線粒體活性氧產(chǎn)生過剩，IL-1β、CCL5、CXCL10分泌增加和脂肪病變[49]。機(jī)制研究表明，胞內(nèi)干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)水平受到降解性自噬調(diào)節(jié)，而由TLR4-TRIF介導(dǎo)的IRF的表達(dá)可調(diào)節(jié)CCL5和CXCL10的分泌[49]從而影響肝損傷進(jìn)程。

3.2 肝纖維化 肝纖維化關(guān)鍵環(huán)節(jié)為肝臟星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的激活[50]，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度蓄積使肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性改變。需要特別關(guān)注的是促炎性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和極化以及促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生可直接激活HSC，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。肝纖維化發(fā)生時(shí)KC細(xì)胞中T細(xì)胞免疫球蛋白域與粘蛋白域-4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-4，TIM-4)表達(dá)增多，對(duì)TIM-4的干擾抑制了蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)介導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)-Parkin、LC3-II/I的激活抑制和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)的分泌減少[51]，通過介導(dǎo)Akt1/線粒體自噬信號(hào)通路，抑制TIM-4可對(duì)抗CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。近期研究[52]指出，抑制巨噬細(xì)胞中單酰甘油脂酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)對(duì)肝纖維化的改善依賴于自噬。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠原代KC中IL-1α和IL-1β分泌增多，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡增多[53]。肝細(xì)胞凋亡是慢性肝病的一個(gè)常見特征，它通過促進(jìn)肝肌成纖維細(xì)胞存活和增強(qiáng)其成纖維原性來促進(jìn)纖維化過程[54]。肝纖維化患者或肝硬化患者的肝單核細(xì)胞中LC-3相關(guān)的吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)增強(qiáng)，對(duì)LAP進(jìn)行抑制肝臟炎癥加重，肝纖維化惡化[55-56]。機(jī)制研究表明，LAP誘導(dǎo)的抗炎和抗纖維化信號(hào)通路是由于Fc免疫受體FCGR2A/FcγRIIA表達(dá)增強(qiáng)和FCGR2A介導(dǎo)的PTPN6/SHP-1抗炎通路的激活，導(dǎo)致LC3+吞噬小體對(duì)IgG的吞噬增加。然而有研究表明，對(duì)HSC自噬的抑制可以阻礙其激活，發(fā)揮抗肝纖維化的作用[57-58]。因此，由于自噬在肝纖維化中具有細(xì)胞特異性的作用，利用自噬途徑進(jìn)行細(xì)胞特異性藥物遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，必定是將自噬作為抗纖維化治療的潛在靶點(diǎn)值得考慮的條件。

3.3 其他相關(guān)肝病 給予高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠LPS刺激后，Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠出現(xiàn)肝臟特異性炎癥，而沒有更嚴(yán)重的脂肪組織炎癥[59]，自噬缺失調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M1極化從而促進(jìn)了肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)。在MCD(methionine-choline-deficient)飲食喂養(yǎng)構(gòu)建的小鼠非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，巨噬細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)水平升高，HIF-1α介導(dǎo)了NF-κB的激活和CCL2的釋放，以及HIF-1α介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬受損增加了IL-1β的產(chǎn)生[60]。然而，自噬的激活需要NF-κB的參與[61]，HIF-1α介導(dǎo)的NASH是否為巨噬細(xì)胞自噬與NF-κB的共同作用還有待進(jìn)一步研究。

癌癥的發(fā)病率和死亡率總體上在下降，但肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率都在上升[62]。自噬缺失的KC在腫瘤形成前階段更易促進(jìn)腫瘤發(fā)生，此過程是線粒體活性氧-NF-κB-IL-1α/β依賴性的[63]。TAM向M1型再極化具有免疫活性，有利于腫瘤消退。研究表明一種天然化合物黃芩苷通過促進(jìn)TAM向M1再極化，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的釋放，抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生發(fā)展，此過程自噬水平升高，介導(dǎo)了TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)的p62依賴性自噬降解，引起NF-κB2通路轉(zhuǎn)錄激活[64]。

4 總結(jié)與展望

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官之一，機(jī)體80%～90%的固有巨噬細(xì)胞存在于肝臟[65]，其對(duì)免疫反應(yīng)的正確調(diào)控具有關(guān)鍵作用，參與了肝臟各種生理病理過程。肝臟發(fā)生病變時(shí)，主要有兩種來源的巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用，分別是來自于肝臟固有駐留巨噬細(xì)胞和外周血的單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在肝病中既具有促進(jìn)炎癥或加重?fù)p傷的作用，又具有抗炎或促進(jìn)修復(fù)和促進(jìn)纖維化的作用，其功能與巨噬細(xì)胞狀態(tài)直接相關(guān)，巨噬細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)變受到多種刺激和周圍環(huán)境的調(diào)控。作為一種天然的細(xì)胞防御生理過程，自噬參與了先天免疫反應(yīng)。大量研究揭示了自噬與巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控具有密切聯(lián)系：從巨噬細(xì)胞分化到巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化，再到細(xì)胞因子的釋放和炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞幾乎所有的功能都與自噬相關(guān)。盡管對(duì)巨噬細(xì)胞自噬在肝病中的作用研究越來越多，但仍舊存在諸多尚未解決的問題，例如：不同肝病中，自噬調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的具體作用機(jī)制；由于自噬在不同細(xì)胞中作用的差異，如何靶向特定細(xì)胞設(shè)計(jì)調(diào)控自噬的藥物；自噬如何調(diào)控巨噬細(xì)胞成熟分化的不同階段等，這些問題的提出與解決將為以巨噬細(xì)胞自噬為靶標(biāo)預(yù)防和治療肝病提供全新的探究方向。