仇立志，王京端，王海燕

(上海醫(yī)藥集團青島國風藥業(yè)股份有限公司，山東 青島 266510)

高磷血癥是導致終末期腎臟病患者多器官功能損傷的關鍵因素[1]，因此降磷治療對患者血磷水平達標非常重要。目前，臨床上常用的磷結合劑分為傳統(tǒng)型磷結合劑和新型磷結合劑[2]。其中，傳統(tǒng)型磷結合劑以含鋁、鈣成分為主[3]，但由于副作用較大[4]，臨床使用量逐年減少。新型磷結合劑以碳酸鑭、司維拉姆、PA21和檸檬酸鐵等[5-8]為主，其降磷效果明顯，副作用相對較少，偶有胃腸道不良反應[9],但是價格昂貴。最新獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市的檸檬酸鐵片不僅可用于非透析慢性腎臟病缺鐵性貧血的治療[10-11]，而且可用于慢性腎病透析患者的高磷血癥治療。該品種的上市，為含鐵類化合物的降磷研究提供了較好的指導意義。多糖鐵復合物膠囊在臨床上主要是用于妊娠期婦女缺鐵性貧血的治療[12]，具有含鐵量高、療效好、副作用小、配合物穩(wěn)定等優(yōu)點[13]。本試驗研究了多糖鐵復合物膠囊在體外的降磷效果，并與其他磷結合劑進行了體外降磷效果對比，為后續(xù)開展相關臨床研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 多糖鐵復合物膠囊(上海醫(yī)藥集團青島國風藥業(yè)股份有限公司，批號：160401)；復方氫氧化鋁片(青島黃海制藥有限責任公司，批號：1509211)；碳酸鈣D3片(北京康遠制藥有限公司，批號：20151255)；司維拉姆片(美國Genzyme生物制藥公司，B5320B01)；碳酸鑭咀嚼片(英國HamolLimited，BJ408)；硫酸(新天化工試劑廠，分析純)；鹽酸(天津市大茂化學試劑廠，分析純)；抗壞血酸(天津市科威化學試劑有限公司，分析純)；鉬酸銨(上海銀典化工有限公司，分析純)；酒石酸銻氧鉀(天津廣成化學試劑有限公司，分析純)；磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；水(娃哈哈純凈水)等。

1.2 儀器設備 Shimadzu島津UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；JJ-4S六聯(lián)數(shù)顯恒溫水浴電動攪拌器(常州國宇儀器制造有限公司)；Mettler Toledo(梅特勒-托利多) ML204型電子分析天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]；H1650-W醫(yī)用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 多糖鐵復合物膠囊磷結合過程中影響因素考察

1.3.1.1 時間因素影響 將多糖鐵復合物膠囊加入模擬胃液(pH 1.2)配制的KH2PO4的溶液中，水浴加熱，每隔10、30、60、90和120 min取少量反應液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標準曲線的試驗步驟進行測定，計算磷結合率。

1.3.1.2 溫度因素影響 將多糖鐵復合物膠囊加入模擬胃液(pH 1.2)配制的KH2PO4的溶液中,選取25、37和45 ℃[14]3個條件下反應一定時間，取少量反應液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標準曲線的試驗步驟進行測定，計算磷結合率。

1.3.1.3 pH因素影響 將多糖鐵復合物膠囊加入KH2PO4的溶液中，調pH分別為1.2、3.0、5.0和8.0，水浴加熱，反應120 min，取少量反應液于1.5 mL離心管中，離心，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用純化水定容。按鉬銻抗法按照繪制標準曲線的試驗步驟進行測定，計算磷結合率。

1.3.2 正交試驗設計篩選多糖鐵復合物膠囊降磷條件 將一定量的多糖鐵復合物膠囊加入KH2PO4水溶液中，調pH，水浴加熱，反應一定時間[15]，取少量反應液于離心管中，在轉速10 000 r·min-1的高速離心機中離心，取上清液配制供試品。之后按鉬銻抗法[16]按照繪制標準曲線的試驗步驟進行測定，計算磷結合率。

磷結合率=(反應前測定量-反應后測定量)/反應前測定量×100%

采用時間(A)、溫度(B)和pH值(C)3個因素，選取3個水平進行L934正交試驗設計，結果見表1。

表1 正交試驗因素及水平

1.3.3 降磷效果評價方法

1.3.3.1 溶液的配制 硫酸溶液：量取50 mL濃硫酸(ρ為1.84 cm-3)，緩慢倒入50 mL純化水中，混均，備用。

10%抗壞血酸溶液：稱取10.0 g抗壞血酸，用純化水溶解，并稀釋至100 mL，最后貯存于棕色玻璃瓶中。

鉬酸鹽溶液：稱取13.0 g鉬酸銨溶解于100 mL純化水中。稱取0.35 g酒石酸銻氧鉀溶解于100 mL純化水中。之后將鉬酸銨溶液緩慢地加入300 mL硫酸溶液中，邊加邊攪拌，再將100 mL酒石酸銻氧鉀溶液一并加入，最終混合均勻，貯存于棕色瓶中，并在4 ℃下保存。

磷酸鹽儲備溶液：先將磷酸二氫鉀在110 ℃條件下干燥2 h，并在干燥器中冷卻至室溫。稱取0.219 7 g磷酸二氫鉀于1 000 mL容量瓶中，并用純化水溶解，之后滴加5 mL硫酸溶液，混勻，最終用純化水定容至標線。此儲備溶液相當于含磷50.0 μg·mL-1。

磷酸鹽標準溶液：量取5.00 mL磷酸鹽儲備溶液，移入50 mL容量瓶中，用純化水定容至標線。稀釋后的溶液相當于含磷5.00 μg·mL-1。

1.3.3.2 模擬體液的配制 模擬胃液的配制：將5 mL的HCl加入500 mL純化水中，調節(jié)至pH=1.2。

1.3.4 標準曲線繪制 量取標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，加入10 mL純化水稀釋，再加入1.0 mL 10%抗壞血酸溶液，混勻。30 min后再加入2 mL鉬酸鹽溶液，充分混勻，放置60 min；采用分光光度法測定并繪制曲線。

1.4 多糖鐵復合物膠囊降磷效果考察 取不同量的多糖鐵復合物膠囊按“1.3.2”項下的方法進行磷結合，之后按照繪制標準曲線的試驗步驟進行測定，計算磷結合率。

1.5 不同磷結合劑降磷效果的比較 分別稱取一定量的復方氫氧化鋁片、碳酸鈣D3片、司維拉姆片、碳酸鑭咀嚼片加入模擬胃液配置的磷酸二氫鉀的溶液中，用鉬銻抗法測定，計算磷結合率。

2 結果

2.1 標準曲線 本試驗所采用的鉬銻抗法要求磷元素的濃度在小于1.2 μg·mL-1，這樣得出的結果在0～1.2 μg·mL-1區(qū)間內有很好的線性關系，回歸方程為Y=0.711 3X-0.041，R2=0.990 3。

2.2 多糖鐵復合物膠囊磷結合過程中影響因素考察結果

2.2.1 時間影響 多糖鐵與磷酸鹽的結合效果是隨著時間的延長而增加。這是由于多糖鐵與磷酸鹽在酸性介質里接觸時間越長，利用多糖鐵中鐵離子的解離，從而導致磷結合率升高，結果見表2。

表2 時間對多糖鐵復合物膠囊磷結合的影響

2.2.2 溫度影響 多糖鐵與磷酸鹽的結合效果隨著介質溫度升高而降磷效果明顯。這是因為在酸性條件下，溫度升高會加快多糖鐵中鐵離子的解離，且與磷酸鹽快速反應，致使磷結合率升高。但是考慮人體環(huán)境的特殊性，溫度不能超過37 ℃，所以，最終選界定溫度為37 ℃，結果見表3。

表3 溫度對多糖鐵復合物膠囊磷結合的影響

2.2.3 pH影響 介質pH值會影響多糖鐵與磷酸鹽的結合效果。在pH值低的情況下多糖鐵與磷酸鹽具有明顯的結合效果；隨著pH值升高，多糖鐵與磷酸鹽結合率明顯降低，主要原因是pH值太高抑制鐵離子解離從而影響多糖鐵溶解度，致使鐵離子與磷酸鹽結合率降低，結果見表4。

表4 pH值對多糖鐵復合物膠囊磷結合的影響

2.3 正交試驗結果 由方差分析可知，多糖鐵復合物膠囊在模擬人體環(huán)境下降磷效果研究中，因素C的影響差異具有顯著性，各因素對磷酸鹽結合率影響順序為C>B>A，與單因素試驗結果基本一致，即pH值對磷結合率影響較大，其次是溫度和時間，結果見表5～6。所以，多糖鐵復合物膠囊在模擬人體環(huán)境下降磷最佳方法是C2B2A3，即pH值為3.0，水浴37 ℃，反應120 min。

表6 正交試驗方差分析

2.4 多糖鐵復合物膠囊降磷效果考察 為考察多糖鐵復合物膠囊降磷效果，將不同劑量的多糖鐵復合物膠囊在正交試驗優(yōu)選的條件下開展降磷效果研究，結果見表7。

表7 不同劑量的多糖鐵復合物膠囊磷結合率

2.5 多糖鐵復合物膠囊與磷結合劑降磷效果的比較 為考察多糖鐵復合物膠囊與不同磷結合劑之間的降磷效果，在同一劑量及條件下，將多糖鐵復合物膠囊與磷結合劑在正交試驗優(yōu)選的條件下開展研究，結果見表8。

表8 多糖鐵復合物膠囊與磷結合劑降磷效果比較

3 討論

本試驗模型主要是模擬人體消化道內酸堿條件，諸如消化酶、膽汁和氯化鈉等并未含在模擬條件中[17]。通過影響因素試驗和正交試驗結果提示，多糖鐵復合物膠囊在磷酸鹽結合過程中，磷結合率主要受pH值影響。當pH 1.2～5時，多糖鐵復合物膠囊有較強的磷結合能力，尤其是pH為3時，磷結合能力最強；當pH為弱堿性時，磷結合能力較弱。這表明多糖鐵復合物膠囊在胃或十二指腸和空腸均能與磷酸鹽結合，且在胃環(huán)境內磷結合效果最佳。

目前，臨床上使用的磷結合劑有碳酸鈣片、氫氧化鋁片[3]、司維拉姆片[6]以及碳酸鑭咀嚼片[5]等，由于他們具有較強的磷結合能力，是目前治療高磷血癥的首選藥物。為了評估多糖鐵復合物膠囊的降磷效果，將多糖鐵復合物膠囊與不同磷結合劑進行比較，在相同條件和劑量下多糖鐵復合物膠囊降磷效果優(yōu)于復方氫氧化鋁片、碳酸鑭咀嚼片(P<0.01)和碳酸鈣片(P<0.05)，但略差于司維拉姆片(P<0.01)。

本試驗多糖鐵復合物膠囊在模擬人體環(huán)境下的降磷效果研究中，多糖鐵復合物膠囊可以明顯地降低磷酸鹽含量，且與劑量呈正相關性，隨著劑量的增加，降磷效果越好。當多糖鐵復合物膠囊的劑量(以鐵計)為3 000 mg時，磷結合率高達80.01%。所以，將多糖鐵復合物膠囊開發(fā)成含鐵磷結合劑，既可以補鐵補血又可以降低磷酸鹽，且副作用少，將具有良好的應用前景。