徐易德，陳琪，白雪瑩，韓亞錄，張云霞，常福厚,2,3

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)作為最常見的腎癌形式，約占成人癌癥的2%～3%[1]，其中接近25%～30%的RCC患者被診斷為局部晚期甚至轉(zhuǎn)移階段，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[2]。臨床病理學(xué)分析大多數(shù)RCC屬于透明細(xì)胞亞型(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，其中約10%為乳頭狀亞型，5%為嫌色細(xì)胞型，其他亞型如集合管癌、移行細(xì)胞癌和髓樣癌約占5%～10%[3]。RCC的治療方式包括手術(shù)切除和放療，治療藥物包括VEGF和VEGF-R抑制劑，mTOR抑制劑以及免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)近幾年也同樣受到關(guān)注[4-6]，然而，腫瘤對化療不敏感性以及逐漸形成多藥耐藥性，是治療RCC的難點之一。因此需要尋找更加合適的治療方式。

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，在中藥中尋找干預(yù)癌癥的天然化合物的研究愈發(fā)涌現(xiàn)。本研究利用生物信息以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選ccRCC癌變和進(jìn)展的差異表達(dá)基因 (differentially expressed genes， DEGs)，探究ccRCC相關(guān)機(jī)制，接著通過文本挖掘?qū)ふ铱捎绊戧P(guān)鍵靶點的天然化合物，借助在線數(shù)據(jù)平臺反向?qū)ふ液心繕?biāo)化合物的中藥，為中醫(yī)藥干預(yù)ccRCC的研究鋪墊基礎(chǔ)工作。

1 資料方法

1.1 腎透明組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲取 ccRCC芯片數(shù)據(jù)GSE781[7]源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中的GEO數(shù)據(jù)庫[8](Gene Express Ominibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，該數(shù)據(jù)集包含17個組織樣品的基因芯片表達(dá)譜，其中12例ccRCC組織和5例鄰近癌癥的正常組織。每個總RNA樣品均與兩個不同的陣列雜交：Affymetrix U133A(GPL96，Affymetrix Human Genome U133A Array)和U133B(GPL97，Affymetrix Human Genome U133B Array)。

1.2 篩選癌癥差異表達(dá)基因 借助GEO2R在線分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)，為精準(zhǔn)篩選差異目標(biāo)，將P<0.05和∣log2(fold change)∣>2為截取標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行ccRCC 組織相對正常鄰旁組織的 DEGs 分析。并利用Venn[9](http://www.biovenn.nl/index.php)統(tǒng)計兩組共有的上、下調(diào)基因。

1.3 差異基因的功能富集 為明確DEGs的功能以及分布區(qū)域，對其進(jìn)行基因功能富集分析，包括生物過程(biologicalprocess，BP)、分子功能(molecular function， MF)和細(xì)胞成分(cellular component， CC)。將DEGs導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫[10](https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因功能富集的同時預(yù)測DEGs映射的KEGG通路。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)篩選核心基因 STRING 數(shù)據(jù)庫[11]https://string-db.org/cgi/input.pl)可以預(yù)測蛋白質(zhì)及研究蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。將DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫計算后可視化展示，可視化條件為combine score≥0.7，在隱藏孤立及部分連接節(jié)點后，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(protein protein interac-tion，PPI)，使用Cytoscape軟件中的cytohuba插件基于重要程度篩選關(guān)鍵基因。

1.5 核心基因的預(yù)后分析 運用基因表達(dá)譜動態(tài)數(shù)據(jù)庫GEPIA[12](http://gepia.cancer-pku.cn/)，以標(biāo)準(zhǔn)條件∣log2(fold change)∣>1、P<0.01對篩選得到的核心基因在ccRCC進(jìn)行表達(dá)水平的驗證，驗證背景JitterSize=0.4，匹配數(shù)據(jù)庫為TCGA以及GTEx。同時評估利用生存曲線明確核心基因在ccRCC患者中的預(yù)后價值。

1.6 影響核心基因的潛在中藥成分 明確具有預(yù)后價值的核心基因后，借助在線工具毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫 CTD[13](http://ctdbase.org/)搜索基于文獻(xiàn)報道與核心基因具有相互作用的化合物，對得到的化合物進(jìn)行整理分類得到天然化合物。

1.7 基于潛在化合物反向篩選中藥 得到目標(biāo)天然化合物后，反向篩選含有目標(biāo)化合物的中草藥，分析過程利用TCMSP[14](https://tcmspw.com/index.php)數(shù)據(jù)庫探索。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC對于正常組織中的DEGs 對基因芯片GSE781進(jìn)行分析，在GPL96中篩選到 552個差異DEGs，包括264個上調(diào)基因和258個下調(diào)基因 (見圖1A)； 在GPL97中檢測到220個顯著DEGs，包括110個上調(diào)基因和110個下調(diào)基因(見圖1B)。將兩組中共有357個上調(diào)基因，353個下調(diào)基因定義為ccRCCDEGs(見圖1C/D)。

圖1 ccRCCDEGs火山圖及Venn圖

2.2 篩選獲取的核心基因 將ccRCCDEGs輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape軟件處理PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用MCODE插件對目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，Degree Cutoff:2，其余參數(shù)默認(rèn)。得到27個模塊，圖中展示分?jǐn)?shù)前五的模塊(見圖2A)，結(jié)果得到模塊基因大多為上調(diào)基因。利用cytohuba基于degree篩選排名前20的基因為核心基因(見圖2B)。

圖2 基因模塊圖及核心基因

2.3 Hub基因在ccRCC標(biāo)本中表達(dá)驗證及其與患者預(yù)后生存的關(guān)系 GEPIA驗證了篩選的20個Hub基因中有15個在ccRCC標(biāo)本中高表達(dá)，2個基因顯著下調(diào)，與正常組織標(biāo)本形成鮮明對比(見圖3)。為了進(jìn)一步探究Hub基因?qū)cRCC預(yù)后的影響，利用Kaplan Meier plotter確定Hub基因的生存數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)特有的9個Hub基因均與ccRCC患者預(yù)后不良相關(guān)(見圖4)，ASPM、BUB1、C3、KIF20A、RRM2、TOP2A的高表達(dá)的總生存期更低，EDN1、PTPN11、VWF的低表達(dá)對生存時間更有利。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證圖

圖4 生存曲線驗證圖

2.4 ccRCCDEGs涉及的生物過程、分子功能、細(xì)胞成分和信號通路 為了解差異基因模塊中有相互作用的基因富集情況，將ccRCCDEGs導(dǎo)入David網(wǎng)站進(jìn)行GO及KEGG富集分析。富集結(jié)果證明在疾病發(fā)生發(fā)展過程中涉及較多生物功能，其中生物過程包括氧化還原過程、排泄、對藥物的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、白細(xì)胞遷移等，分子功能包括蛋白質(zhì)二聚活性、運輸活動、受體結(jié)合、無機(jī)陰離子交換活性、肝素結(jié)合等，細(xì)胞定位在細(xì)胞外泌體、質(zhì)膜的組成部分、頂質(zhì)膜、細(xì)胞外空間、基底外側(cè)質(zhì)膜等。在KEGG信號中富集到PPAR信號通路、碳代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的代謝、代謝途徑、乙醛酸和二羧酸的代謝、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解、PI3K-Akt信號通路、檸檬酸鹽循環(huán)(TCA循環(huán))、泛酸和CoA生物合成等信號通路。

2.5 反向篩選可能影響關(guān)鍵基因的天然化合物及中藥 研究將有明確差異以及有預(yù)后意義的BUB1、C3、KIF20A、RRM2、TOP2A基因確定為目標(biāo)繼續(xù)探究，篩選后得到影響目標(biāo)基因的天然化合物共72個，分析發(fā)現(xiàn)不同化合物對同一目標(biāo)基因的表達(dá)是不同的，如雌二醇可以導(dǎo)致TOP2A mRNA表達(dá)增加，而兒茶素卻導(dǎo)致TOP2A mRNA表達(dá)水平下降。而同一種化合物對得到的不同目標(biāo)基因影響趨勢也不一致，如甲基睪丸激素使RRM2 mRNA表達(dá)增加，但卻誘導(dǎo)TOP2A mRNA表達(dá)降低，具體內(nèi)容如圖5。探索所含篩選化合物的中草藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一種化合物至少對應(yīng)一種中草藥，其中含有如槲皮素的中草藥要多達(dá)188種，篇幅限制，表1中列出藥物最多十種。

表1 含有目標(biāo)化合物的中草藥

圖5 影響目標(biāo)基因的化合物信息及關(guān)系

3 討論

ccRCC早期并無明顯癥狀，臨床診斷不僅缺乏前期診斷標(biāo)志物，而且容易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后差、死亡率高，因涉及基因突變、表觀遺傳、編碼及非編碼基因表達(dá)變化等諸多因素，導(dǎo)致病理發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，以至臨床治療手段受限[15]。外科手術(shù)切除雖然是原發(fā)性腎癌的第一選擇，但總體預(yù)后較差，分子靶向治療也存在個體差異，藥物耐受、費用昂貴等問題依舊對臨床治療提出新的挑戰(zhàn)。

在我國，中醫(yī)藥作為癌癥的治療手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床抗癌，從患者的全身特點和病程考慮用藥，而不只局限在癌癥病灶本身，在癌的綜合治療中發(fā)揮了獨特的作用。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，個體的體質(zhì)是決定機(jī)體發(fā)病的內(nèi)在條件，體質(zhì)因素在某種程度上決定個體對腫瘤的易感性[16]。利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀念闡述此話，則為行使相似功能的蛋白表達(dá)水平不同，故利用基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分析ccRCC與正常人的差異基因，探究在疾病過程中異常表達(dá)的蛋白差異程度，得到結(jié)果為BUB1， KIF20A等目標(biāo)基因高表達(dá)。BUB1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在有絲分裂早期被召集，可促進(jìn)著絲粒紡錘體組裝檢查點(soindle assembly checkpint SAV)的組裝。BUB1被Mps1激酶磷酸化后，招募有絲分裂檢查點復(fù)合體(mitotic checkpoint complex，MCC)，發(fā)出有絲分裂后期的信號[17]。有明確研究發(fā)現(xiàn)BUB1在子宮內(nèi)膜癌[18]、卵巢癌[19]、乳腺癌[20]等多種癌癥中高表達(dá)，證明與腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，并參與細(xì)胞增殖、腫瘤干細(xì)胞潛能等多個過程。KIF20A(Kinesin family member 20A)是驅(qū)動蛋白Kinesin6家族成員，涉及關(guān)鍵細(xì)胞功能，包括細(xì)胞器和囊泡胞內(nèi)運動、紡錘體形成和胞質(zhì)分裂，其表達(dá)水平和活性參與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和細(xì)胞分裂的調(diào)控，在癌癥發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[21]，研究證明如果沉默KIF20A，可以誘導(dǎo)抗紫杉醇乳腺癌細(xì)胞MCF-7的有絲分裂障礙，抑制增殖活性[22]。當(dāng)敲低KIF20A亦可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，出現(xiàn)多核細(xì)胞，可能由于胞質(zhì)分裂異常引起[23]。以上均證實抑制KIF20A基因的表達(dá)時，可發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期、血管生成和抑制轉(zhuǎn)移作用[24]。RRM2(核糖核酸還原酶亞單位M2，ribonucleotide reductase M2)基因是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，在各種惡性腫瘤中都有表達(dá)，同時與腫瘤生長和浸潤呈正相關(guān)，與腫瘤耐藥的形成有密切關(guān)系[25]。細(xì)胞在S期時，RRM2表達(dá)最高，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，顯著促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲，與腫瘤生長密切相關(guān)。目前對 RRM2的研究不多，主要集中在胰腺癌、膀胱癌、胃癌上。RRM2與DNA合成代謝相關(guān)，導(dǎo)致DNA抗損傷能力增加而出現(xiàn)耐藥，抑制RRM2的表達(dá)則降低腫瘤細(xì)胞DNA的抗損傷能力，通過沉默RRM2基因，胃癌細(xì)胞對不同濃度順鉑敏感性顯著提高[26-27]。

表1(續(xù))

表1(續(xù))

TOP2A(拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα)又稱旋轉(zhuǎn)酶，參與機(jī)體內(nèi)基因復(fù)制、細(xì)胞增殖等過程[28]。具有明顯的細(xì)胞周期特異性，在細(xì)胞增殖S期末和G2/M過渡期高表達(dá)，而在有絲分裂結(jié)束后表達(dá)下調(diào)，當(dāng)細(xì)胞停止增殖活動時，TOP2A的表達(dá)則受到抑制[29]，研究指出，TOP2A是影響胃癌患者總生存期的獨立危險因素[30]。以上討論證明利用生物信息學(xué)方法篩選得到潛在干預(yù)靶點準(zhǔn)確，但中藥成方制劑直接作用上述靶點研究較少，可能為中醫(yī)并無“腎癌”病名，對于以痛性血尿、腰痛、腰部或上腹部腫塊等臨床表現(xiàn)中醫(yī)將腎癌歸屬 “尿血”“癥積”“腎積”“中石疽”等病的范疇[31]， 腎癌為本虛標(biāo)實病機(jī)，臨床中化痰除濕解毒以及活血化瘀應(yīng)各有側(cè)重。預(yù)測到藥物中豆蔻為芳香化濕藥，川芎、乳香等為活血化瘀藥符合上述辯證觀，今后的治療中在符合中醫(yī)理論指導(dǎo)下可能對ccRCC具有干預(yù)作用。同時全身屬虛，腎癌以氣血俱虛為主，臨證應(yīng)祛邪不忘扶本，尤重氣血，調(diào)理脾腎。研究驗證到本次實驗預(yù)測到當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血之功效，體外實驗中亦驗證可有效抑制人腎透明細(xì)胞癌的增殖，同時對預(yù)測到的PI3k信號通路同樣被顯著干預(yù)[32]。

本次研究中利用生物信息學(xué)的方法探索ccRCC的關(guān)鍵差異靶點，探究疾病對信號通路的多途徑積累改變，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念及中藥多靶弱效的顯著特點相結(jié)合，希望借助現(xiàn)代技術(shù)探索到可干預(yù)中醫(yī)未被定義疾病的中草藥，以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀念剖析中草藥的潛在價值，本研究中發(fā)現(xiàn)同一核心基因可以被多種不同的化合物不同方向干預(yù)，不同成分可能包含于在同一種中草藥中，這對闡述單一中草藥影響ccRCC的不明確作用機(jī)制仍需探索，本研究預(yù)測藥物較多，僅部分藥物或單質(zhì)實驗驗證為對目標(biāo)疾病有療效，但仍未經(jīng)過實驗驗證的預(yù)測結(jié)果需要繼續(xù)深入探索，為中醫(yī)藥的發(fā)展做出努力。