崔乃元，劉怡菲，王 萍，武俠均，劉 薇，邢維維，馬立才，*

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京100095;2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北石家莊050051)

金剛烷胺(Amantadine，AMD)、金剛乙胺(Rimantadine)和索金剛胺(Soramantadine)均屬于金剛烷胺類藥物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，是一類抗病毒藥物［1］，也可以有效緩解帕金森病患者的癥狀［2］。早期應(yīng)用于抑制人類流感病毒，具有價(jià)格低廉、藥效明顯等特點(diǎn)，對(duì)于流感的預(yù)防和治療效果較好，該類藥物在禽類流感的治療上也得到了廣泛的應(yīng)用，但是禽類體內(nèi)過量殘留的金剛烷胺類藥物會(huì)對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生較大危害。2012年的“速成雞”事件中檢測(cè)出雞肉中殘留有金剛烷胺類等抗病毒藥物，給我國(guó)家禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響［3］。該藥物的濫用不僅會(huì)造成雞肉風(fēng)味和品質(zhì)下降，還會(huì)導(dǎo)致病毒抗藥性與藥物殘留的產(chǎn)生，然后通過食物鏈影響消費(fèi)者健康［4］。

圖1 金剛烷胺類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of amantadines

美國(guó)FDA于2006年禁止金剛烷胺類抗流感病毒藥物用于禽類［5］，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2005年在《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》要求禁止生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用金剛烷胺等抗病毒藥物［4，6－7］。因此，為確保動(dòng)物源性食品的安全和對(duì)外出口貿(mào)易的發(fā)展，建立準(zhǔn)確可靠，靈敏度高的禽肉中金剛烷胺類藥物的定性定量檢測(cè)方法是十分必要的。

已有文獻(xiàn)報(bào)道的金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的檢測(cè)方法可分為物理化學(xué)法和免疫化學(xué)法。前者包括高效液相色譜法［8］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC－MS)［9－11］、親水相互作用色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［12］等。后者主要包括酶聯(lián)免疫吸附法［13－18］、免疫層析法［15－16，19］、免疫比色分析［20－21］等。色譜方法雖然準(zhǔn)確度高，但前處理復(fù)雜且檢測(cè)成本高，不適合高通量快速篩選。酶聯(lián)免疫分析法是一種易操作、速度快、成本低廉且檢測(cè)通量高的檢測(cè)方法，被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)中［22－26］。Wu等［16］建立了金剛烷胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA快速定量檢測(cè)方法，其IC50為11.93 ng/mL，檢測(cè)限為1.18 ng/mL，線性范圍為2.5～100 ng/mL;使用ELISA方法檢測(cè)金剛烷胺殘留的報(bào)道很多［27－28］，但檢測(cè)雞肉、鴨肉中金剛烷胺類藥物(金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺)的研究甚少。

本研究設(shè)計(jì)并合成了一種新型的金剛烷胺抗原，通過免疫動(dòng)物獲得了金剛烷胺特異性抗體，進(jìn)而建立了一種檢測(cè)雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的殘留量的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，為禽肉中金剛烷胺類藥物的檢測(cè)和監(jiān)管提供一種重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、辣根過氧化物酶(HRP)、高碘酸鈉(NaIO4)、碳酸鈉(Na2CO3)、硼氫化鈉(NaBH4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等藥物 購(gòu)自Sigma公司;6～8周齡Balb/c(巴比賽)雌鼠、SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞 北京維德維康生物技術(shù)有限公司制備;雞肉、鴨肉樣品 購(gòu)自于北京市海淀區(qū)的上莊水鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和前沙澗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及物美溫泉品超市，每個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)/超市分別購(gòu)買雞肉、鴨肉各10份，共60份樣品。

微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司;ES120電子天平 天津德安特傳感技術(shù)有限公司;Sorvall ST 8冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Fisher Scientific;KQ－100E超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;TSQ Fortis液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;N－EVAP氮吹儀 美國(guó)Organomation公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 包被緩沖液:pH9.6，0.05 mo1/L的碳酸鈉緩沖液;封閉液:每1 L封閉液按照如下方法配制:將5 mL馬血清、1 g疊氮化鈉、30 g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液(PBS濃度為0.02 mol/L，pH為7.2)溶解并定容至1000 mL;底物顯色液:由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1%四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的水溶液;終止液:0.2 mol/L硫酸水溶液;濃縮洗滌液:將10 mL吐溫－20、5 g疊氮化鈉和990 mL磷酸鹽緩沖液混合。

1.2.2 金剛烷胺半抗原的制備 稱取0.94 g金剛烷胺鹽酸鹽溶于30 mL無(wú)水吡啶，加入馬來(lái)酸酐(MAH)0.49 g，溶解后，加入4－二甲氨基吡啶10 mg，70℃回流反應(yīng)3 h，旋蒸除去吡啶，加去離子水10 mL，冰醋酸調(diào)pH5.0，析出大量沉淀，過濾，水洗沉淀，干燥后得半抗原AMD－MAH。

1.2.3 免疫原和包被原的制備 稱取5.57 mg半抗原溶于1 mL N，N－二甲基甲酰胺(DMF)，加入碳化二亞胺(EDC)4.3 mg，N－羥基琥珀酰亞胺(NHS)5.2 mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h;50 mg BSA溶于5 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到5 mL含有1%BSA(包被原:1%OVA)的碳酸氫鈉緩沖溶液中(0.1 mol/L)，室溫?cái)嚢柽^夜，PBS 4℃透析72 h，期間換透析液6次，即得到免疫原AMD－MAH－BSA和包被原AMD－MAH－OVA。將透析液在無(wú)菌條件下過0.22μm孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，－20℃保存。采用MALDI－TOF/MS對(duì)所合成免疫原的偶聯(lián)比進(jìn)行測(cè)定［29］。

1.2.4 單克隆抗體的制備 用上述制備出的免疫原按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28 d以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫1次，融合前3 d以免疫復(fù)合物100μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫1次。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用HT培養(yǎng)基半換液，9 d時(shí)進(jìn)行全換液。全換液后采用間接ELISA方法，選擇和標(biāo)記效價(jià)高、抑制率高的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。若經(jīng)金剛烷胺阻斷后的OD450nm值下降到對(duì)照孔的50%以下，則判為陽(yáng)性，經(jīng)2～3次檢測(cè)都為陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存;并將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔，制備腹水，測(cè)定效價(jià)，并－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 特異性 選擇與金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺具有類似結(jié)構(gòu)或功能的幾種藥物美金剛胺、氧氟沙星、環(huán)丙沙星進(jìn)行ELISA測(cè)定，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其IC50，根據(jù)公式:

式中:IC50(金剛烷胺)為引起50%抑制的金剛烷胺濃度(μg/kg)，IC50(類似物)為引起50%抑制的結(jié)構(gòu)類似物濃度(μg/kg)

1.2.6 ic－ELISA 包被AMD－MAH－OVA的聚苯乙烯酶標(biāo)板:用0.05 mol/L的碳酸鹽溶液將抗原稀釋至2.5μg/mL，包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃溫育2 h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次10 s，拍干，然后在每孔中加入150μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng):加入50μL金剛烷胺類標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液;然后在每孔中加入50μL酶標(biāo)抗體工作液;蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，充分混勻，室溫下(25±2)℃，避光反應(yīng)30 min;揭開蓋板膜;倒掉板孔中液體，在每孔加260μL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15～30 s;倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干;立即在每孔中加入100μL A、B混合液;蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，充分混勻，室溫下(25±2)℃，避光反應(yīng)15～20 min;揭開蓋板膜，在每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，充分混勻;終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450、630 nm下讀取酶標(biāo)板吸光度［30］。

1.2.7 樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取(3±0.05)g均質(zhì)后的雞肉、鴨肉樣品于50 mL離心管中;加入6 mL酸化乙腈(含1%乙酸)，充分渦動(dòng)5 min;室溫(25±2℃)下4000×g離心5 min;取3 mL上清液40～50℃水浴氮?dú)獯蹈?加入2 mL正己烷充分渦動(dòng)30 s，再加入1.0 mL 10 mmol/L PB(含1%BSA，0.5%Tween－20，1%蔗糖)，充分渦動(dòng)30 s;4000×g以上離心5 min;棄去上層正己烷及中間層雜質(zhì);取50μL進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 準(zhǔn)確度和精密度分析 向均質(zhì)后的雞肉、鴨肉空白樣品中添加梯度濃度的金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺溶液，使其終濃度分別為1和2μg/kg，將每個(gè)濃度梯度添加3個(gè)平行;然后按照1.2.6進(jìn)行前處理和檢測(cè)，利用平均值計(jì)算添加回收率，公式如下:

添加回收率(%)=檢測(cè)值/添加值×100

上述實(shí)驗(yàn)在不同工作日內(nèi)重復(fù)3次，分別統(tǒng)計(jì)日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

1.2.9 與儀器方法比較 取雞肉和鴨肉樣品各25份，同時(shí)使用本研究所建立的icELISA方法和GB 31660.5－2019《動(dòng)物性食品中金剛烷胺殘留量的測(cè)定》液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［31］進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)方法的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程中，以樣本中添加的金剛烷胺質(zhì)量濃度(μg/kg)的自然對(duì)數(shù)值為X軸，吸光度OD值為Y軸，采用Origin 8.0軟件擬合四參數(shù)競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原合成的鑒定

采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI－TOF－MS)鑒定免疫原(AMD－MAH－BSA)的結(jié)果如圖2和圖3所示。載體蛋白BSA的分子質(zhì)量為67485.901，AMD－MAH－BSA經(jīng)MALDI－TOFMS測(cè)定的分子質(zhì)量為73828.009。經(jīng)計(jì)算可知，半抗原AMD－MAH與BSA的偶聯(lián)比為25.40。

圖2 BSA的MALDI－TOF－MS圖譜Fig.2 MALDI－TOF－MSspectrum of BSA

圖3 AMD－CMO－BSA的MALDI－TOF－MS圖譜Fig.3 MALDI－TOF－MSspectrum of AMD－CMO－BSA

金剛烷胺半抗原結(jié)構(gòu)如表1所示。Wu等［16］直接采用戊二醛的醛基與金剛烷胺和載體蛋白氨基縮合成Schiff堿而進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)合成金剛烷胺全抗原，檢測(cè)方法的IC50為11.93μg/L。Peng等［13］加入丁二酸酐與金剛烷胺氨基結(jié)合生成酰胺作為金剛烷胺半抗原，測(cè)得其檢測(cè)方法的IC50為15.8μg/L。與本文所建立的ic－ELISA方法相比，上述兩種方法所制備的抗體靈敏度均較低，這可能因?yàn)槠浒肟乖肿訕O性低不利于產(chǎn)生高親和力的抗體導(dǎo)致的。

由于金剛烷胺烷烴分子間作用力少，不利于產(chǎn)生抗體，因此本研究通過引入馬來(lái)酸酐作為碳鏈，使電子云密度加大有利于金剛烷胺產(chǎn)生抗體。同時(shí)最大限度的保留了金剛烷胺的結(jié)構(gòu)，以利于產(chǎn)生具有高特異性的抗體。

2.2 特異性

用建立的方法對(duì)緩沖體系中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺及其他臨床常用藥物進(jìn)行測(cè)試，本研究所制備單克隆抗體的靈敏度和交叉反應(yīng)率如表2所示。金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的IC50依次為0.316、0.136和0.131 μg/kg，但 是 與 美 金 剛 胺(＜1%)、氧氟沙星(＜0.1%)和環(huán)丙沙星(＜0.1%)的交叉反應(yīng)率均較低。由此可見，本研究所制備的單克隆抗體具有良好的靈敏度和特異性。

表1 金剛烷胺半抗原結(jié)構(gòu)對(duì)比Table 1 Comparison of the haptens structure for determination of AMA

表2 用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺交叉反應(yīng)率Table 2 Cross reaction rate of amantadine，amantadine and soamantadine measured by indirect competitive ELISA

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取雞肉和鴨肉樣本，向其中添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液使其質(zhì)量濃度分別為(0、0.1、0.3、0.9、2.7和8.1μg/kg)，按照1.2.6和1.2.7節(jié)所述進(jìn)行樣本前處理及分析檢測(cè)，并依據(jù)1.3節(jié)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。結(jié)果顯示，其曲線回歸方程為:雞肉:Y=0.071+(2.336－0.071)/(1+(x/0.333)1.257)，線性決定系數(shù)R2為0.9958，線性范圍為0.603μg/kg～3.104μg/kg;鴨肉:Y=－0.487+(2.039+0.487)/(1+(x/0.878)0.499)，線性決定系數(shù)R2為0.9990，線性范圍為0.592～6.311μg/kg。

2.4 檢測(cè)限和定量限

按照農(nóng)業(yè)部規(guī)定的方法［32］:分別測(cè)定20份空白雞肉、鴨肉樣品，取其平均值，加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定試劑盒的最低檢測(cè)限，加上10倍標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定試劑盒的定量限。具體數(shù)據(jù)如表3所示，金剛烷胺、金剛乙 胺、索 金 剛 胺 的 檢 測(cè) 限 分 別 為:0.57、0.42、0.41μg/kg(雞肉)和0.59、0.40、0.38μg/kg(鴨肉);定量限分別為0.85、0.63、0.69μg/kg(雞肉)和0.94、0.68、0.52μg/kg(鴨肉)。

圖4 ic－ELISA檢測(cè)金剛烷胺類的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for detection of amantadine by ic－ELISA

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

在3個(gè)批次的雞肉、鴨肉樣品中依次添加終濃度為1、2μg/kg金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行添加回收測(cè)定。結(jié)果如表4所示，本方法雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺的回收率為67.0%～117.9%;日內(nèi)變異系數(shù)在6.3%～12.7%，日間變異系數(shù)在8.1%～14.5%之間，均小于15%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 與國(guó)標(biāo)方法比較

為了驗(yàn)證酶聯(lián)免疫法在實(shí)際工作中對(duì)真實(shí)樣品中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺測(cè)定的準(zhǔn)確性，采用本方法與HPLC－MS［30］方法分別對(duì)25份雞肉和25份鴨肉盲樣進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定結(jié)果。由表5可知，兩種方法檢測(cè)雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺殘留的結(jié)果一致性較高，與儀器方法相比，本文建立的ic－ELISA方法具有靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于批量樣本的快速篩查，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

綜上所述，本文采用ic－ELISA技術(shù)建立了一種檢測(cè)雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺殘留的方法，其金剛烷胺、金剛乙胺、索金剛胺的檢測(cè)限分別為:0.57、0.42、0.41μg/kg(雞肉)和0.59、0.40、0.38μg/kg(鴨 肉);定 量 限 分 別 為0.85、0.63、0.69μg/kg(雞肉)和0.94、0.68、0.52μg/kg(鴨肉)，而且與其他幾種臨床常用藥物交叉反應(yīng)率低，說明方法具有良好的特異性。雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺的添加回收率在67.0%～117.9%之間;日內(nèi)變異系數(shù)為6.3%～12.7%，日間變異系數(shù)為8.1%～14.5%，均小于15%，且實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與HPLC－MS一致性較高(R2=0.9990)。由此表明，本研究所建立的檢測(cè)雞肉、鴨肉中金剛烷胺、金剛乙胺和索金剛胺殘留的icELISA測(cè)定方法具有靈敏，準(zhǔn)確精密的特點(diǎn)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表3 金剛烷胺類藥物檢出限和定量限驗(yàn)證(n=20)Table 3 Verification of detection and quantitation limits for amantadines(n=20)

表4 日內(nèi)、日間變異系數(shù)Table 4 Intra－and inter－day coefficient of variation

表5 檢測(cè)金剛烷胺與儀器方法比較結(jié)果(μg/kg)aTable 5 Comparison results with instrument methods(μg/kg)