賀銀菊，張旋俊，楊再波，彭莘媚，卯申發(fā)

(1.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州都勻558000;2.貴州省高校民族藥用植物資源開發(fā)工程研究中心，貴州都勻558000)

西番蓮(Passionfruit)又稱百香果、雞蛋果、巴西果，是西番蓮科多年木質(zhì)藤本植物，西番蓮主要有黃果、紫果、紫紅色果三個(gè)品種，其果實(shí)氣味芳香濃郁，有“果汁之王”的美譽(yù)［1］。西番蓮果實(shí)、種籽、果皮、莖、葉中均含有多種活性成分［2］，具有抗氧化［3］、抗菌［4］、抗炎［5］、抗抑郁［6］、抗疲勞［7］、降血壓［8］等生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，西番蓮葉有抑菌、抗焦慮、保護(hù)神經(jīng)等功效，其主要活性成分為三萜類、黃酮類、生物堿、酚類等物質(zhì)［2］。在南美洲及歐洲的民間，西番蓮葉被當(dāng)作藥物，用于治療神經(jīng)緊張、偏頭痛、酒精中毒等疾病［9］。目前國(guó)內(nèi)對(duì)西番蓮的研究主要集中在果實(shí)中果汁、果皮及種子中的化學(xué)物質(zhì)［10］，對(duì)西番蓮葉的應(yīng)用研究較少。

植物多酚具有抗菌［11］、抗病毒［12］、抗氧化［13］、降血脂［14］、抗腫瘤［15］、抗癌［16］及增強(qiáng)免疫力［17］等多種藥理活性，其分離提取工藝研究備受關(guān)注。傳統(tǒng)的提取多酚方法有煎煮法［18］、滲漉法［19］、有機(jī)溶劑法［20］等，近年來借助微波輔助［21］、超聲輔助［22］、酶輔助［23］及超臨界流體萃取［24］等方法提取多酚的應(yīng)用越來越多，其中超聲輔助法是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞植物細(xì)胞，使溶劑滲透到植物細(xì)胞中去，可縮短提取時(shí)間、提高提取率。

查詢文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)西番蓮葉中活性成分提取的報(bào)道較少，主要報(bào)道了其黃酮的提取及抗氧化活性［25］，對(duì)西番蓮葉中多酚提取的文獻(xiàn)未見報(bào)道。為研究西番蓮葉中多酚提取量，本文以紫果西番蓮葉為對(duì)象，借助超聲輔助法優(yōu)化其多酚的提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上通過Box－Behnken設(shè)計(jì)－響應(yīng)面考察液料比、提取時(shí)間、超聲功率和超聲溫度對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響，采用酒石酸亞鐵法測(cè)定其多酚提取量，并以清除DPPH自由基和·OH能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性，期望為進(jìn)一步開發(fā)紫果西番蓮的附加價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫果西番蓮葉 紫果西番蓮采于貴州省平塘縣塘邊鎮(zhèn)新街村，洗凈烘干，粉碎機(jī)打碎后過60目篩備用;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(＞98%)合肥博美生物科技有限公司;DPPH(＞99%)、鄰二氮菲(＞99%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;維生素C(AR)、酒石酸鉀鈉(AR)天津福晨化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵(AR)西隴化工化學(xué)試劑;磷酸氫二鈉(AR)、磷酸二氫鉀(AR)、無水乙醇(AR)重慶川東化工。

粉碎機(jī) 浙江金華武義屹立儀器公司;DZ－2A型真空干燥箱、SHZ－D型循環(huán)水真空泵 鄭州英峪予華儀器有限公司;TP－A200型電子天平 上海諾萱科學(xué)儀器有限公司;FA2204型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV－1800型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫果西番蓮葉多酚提取 稱取1.0 g紫果西番蓮葉粉末于錐形瓶中，以95%乙醇溶液為提取溶劑，按照一定液料比、提取時(shí)間、超聲功率和超聲溫度進(jìn)行提取，提取完成后濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶定容，得樣品溶液，備用。

1.2.2 紫果西番蓮葉多酚的測(cè)定

1.2.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容，得1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。酒石酸亞鐵溶液、p H=7.5的緩沖溶液按照GB/T 21733－2008配制［26］。

采用酒石酸亞鐵法:分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，補(bǔ)水至1 mL，加入酒石酸亞鐵溶液3.0 mL，搖勻后以pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容混勻，在540 nm處測(cè)定其吸光度。以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:y=0.01243x+0.02677，R2=0.99989。結(jié)果表明:在濃度為10～50μg/mL范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 紫果西番蓮葉多酚提取 按照1.2.1中紫果西番蓮葉多酚提取的方法，將樣品溶液稀釋50倍后即得待測(cè)液，取1 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶中，按照1.2.1的方法測(cè)定待測(cè)液濃度，按照下式計(jì)算紫果西番蓮葉多酚提取量(Y):

Y(mg/g)=C×V×N/m×10－3

式中:C為待測(cè)液濃度，μg/mL;V為樣品溶液的體積，mL;N為總稀釋倍數(shù);m為紫果西番蓮葉的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1中的提取方法，試驗(yàn)基本條件定為:液料比25∶1 mL/g，提取時(shí)間40 min，超聲功率300 W和超聲溫度60℃。單因素實(shí)驗(yàn)條件為液料比(5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1 mL/g)、提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)和超聲溫度(40、50、60、70、80℃)，分別考察液料比、提取時(shí)間、超聲功率和超聲溫度對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Box－Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素和水平見表1。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，并計(jì)算多酚提取量。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors table of response surface methodology

1.2.5 紫果西番蓮葉多酚抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 清除DPPH自由基活性 參照賀銀菊等［27］方法:取2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL不同濃度(濃度依次為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL)的樣品溶液于10 mL比色管中，放置30 min，以蒸餾水做參比，在517 nm處測(cè)定其吸光度為A0，按照同樣的方法測(cè)定2.0 mL 80%乙醇溶液和不同濃度多酚樣品液2.0 mL的吸光度為A1，2.0 mL 80%乙醇溶液和2.0 mL DPPH溶液的吸光度為A2。以維生素C為對(duì)照品，DPPH自由基清除率計(jì)算公式:

清除率(%)=［1－(A0－A1)/A2］×100

1.2.5.2 清除·OH活性 參照賀銀菊等［27］方法:取1.5 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 mL pH=7.5的磷酸鹽緩沖液，再加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，蒸餾水定容，在37℃的水浴保溫1 h，在510 nm處測(cè)定吸光度得A0;取1.5 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 mL pH=7.5的 磷 酸 鹽 緩 沖 液，再 加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，加入1.0 mL 1.0 mL/L的H2O2，蒸餾水定容，在37℃的水浴保溫1 h，在510 nm處測(cè)定吸光度得A1;取1.5 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 m L p H=7.5的磷酸鹽緩沖液，再加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，分別加入0.1 mL不同濃度(濃度依次為0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)的樣品溶液，再加1.0 mL 1.0 mL/L的H2O2，蒸餾水定容，37℃水浴保溫1 h，在510 nm處測(cè)定吸光度得A2。以維生素C為對(duì)照品，按下式計(jì)算·OH清除率:

清除率(%)=(A0－A2)/(A0－A1)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)及抗氧化活性數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件分析;響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design－Expert V8.0.6軟件分析結(jié)果及方差，并進(jìn)行模型分析優(yōu)化提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響 液料比對(duì)紫果西番蓮葉中多酚提取量的影響見圖1。由圖1可知，隨著液料比的增加，紫果西番蓮葉中多酚提取量升高;當(dāng)液料比為35∶1 mL/g時(shí)，紫果西番蓮葉中多酚提取量最高，此時(shí)多酚提取量為13.31 mg/g。這是因?yàn)楫?dāng)液料比較小時(shí)，溶液粘稠度高，不利于多酚在溶劑中的擴(kuò)散，多酚溶出量少，隨著液料比的增大，溶液粘稠度降低，多酚在溶劑中擴(kuò)散快，多酚溶出量多，到達(dá)35∶1 mL/g時(shí)，多酚已基本溶出。當(dāng)液料比超過35∶1 mL/g，隨著液料比的增大，紫果西番蓮葉中多酚提取率反而下降，這是因?yàn)槎喾右讶艹鐾耆?，再增加溶劑用量雜質(zhì)，雜質(zhì)溶出增多抑制多酚溶出，多酚的濃度反而降低，因此較優(yōu)液料比為35∶1 mL/g。

圖1 液料比對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響Fig.1 Effect of solvent to material ratio on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響 提取時(shí)間對(duì)紫果西番蓮葉中多酚提取量的影響見圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，紫果西番蓮葉中多酚提取量升高;當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，紫果西番蓮葉中多酚提取量最高，此時(shí)多酚提取量為12.90 mg/g。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，多酚溶出量增加，提取時(shí)間為50 min時(shí)，多酚已基本溶出;再延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提取量貢獻(xiàn)不大，反而使多酚在機(jī)械波和熱效應(yīng)的影響下不穩(wěn)定，被分解或氧化成其他物質(zhì)［28］，使多酚提取量降低，因此較優(yōu)提取時(shí)間為50 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.3 超聲功率對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響 超聲功率對(duì)紫果西番蓮葉中多酚提取量的影響見圖3。由圖3可知，隨著超聲功率的增加，紫果西番蓮葉中多酚提取量升高;當(dāng)超聲功率為350 W時(shí)，紫果西番蓮葉中多酚提取量最高，此時(shí)多酚提取量為12.84 mg/g。這是因?yàn)槌暪β试鰪?qiáng)后，超聲波的振蕩增強(qiáng)，超聲波破壞樣品細(xì)胞壁后溶劑進(jìn)入固體樣品內(nèi)部，多酚溶出量增加，當(dāng)超聲功率為350 W時(shí)，多酚已基本溶出，再增加超聲功率紫果西番蓮葉中多酚提取量反而降低，這是因?yàn)槎喾咏Y(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)溶出的雜質(zhì)也增多，使多酚提取量反而降低，因此較優(yōu)超聲功率為350 W。

圖3 超聲功率對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.4 超聲溫度對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響 超聲溫度對(duì)紫果西番蓮葉中多酚提取量的影響見圖4。由圖4可見，隨著超聲溫度的升高，紫果西番蓮葉中多酚提取量升高，當(dāng)超聲溫度為70℃時(shí)紫果西番蓮葉中多酚提取量最高，此時(shí)多酚提取量為13.11 mg/g。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，液固接觸機(jī)率增多，多酚溶出增加;當(dāng)超聲溫度為70℃時(shí)，多酚已基本溶出，再升高超聲溫度，會(huì)因?yàn)闇囟冗^高，使溶劑易變?yōu)檎羝?，?shí)際參與提取的溶劑量減少，同時(shí)溫度過高導(dǎo)致多酚分解和氧化，因此多酚提取反而降低，因此較優(yōu)超聲溫度為70℃。

圖4 超聲溫度對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box－Benhnken的中心組合原理設(shè)計(jì)了29組試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。用Design－Expert V8.0.6進(jìn)行分析與擬合后，得紫果西番蓮葉多酚提取量(Y)的回歸方程:

Y(mg/g)=13.11+0.47A+1.10B+0.15C+0.058D－0.20AB－0.035AC－0.13AD+0.002.500BC－0.025BD+0.000CD－0.98A2－1.26B2－1.06C2－1.08D2。

響應(yīng)面分析模型的方差分析見表3。由表3可知，模型的P值小于0.0001，說明試驗(yàn)二次模型擬合度較高，可正確反映各提取因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。模型的決定系數(shù)、校正確定系數(shù)分別為R2=0.9896和，變異系數(shù)CV=1.50%較小，失擬項(xiàng)P值為0.7414大于0.05，說明模型擬合好、穩(wěn)定、可靠。因素A、B、C、A2、B2、C2、D2對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量影響極顯著(P＜0.01)，交互項(xiàng)AB對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量影響顯著(0.01＜P＜0.05)，因素D及交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD、CD對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量沒有顯著性影響(P＞0.05)。由表3模型的方差分析可得出4個(gè)因素對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量影響順序?yàn)樘崛r(shí)間(B)＞液料比(A)＞超聲功率(C)＞超聲溫度(D)。

兩兩因素交互作用響應(yīng)面見圖5，由圖5可知:各因素交互作用響應(yīng)面開口均向下，說明響應(yīng)面值均隨每個(gè)因素增大而增大，達(dá)到峰值后又逐漸減小。響應(yīng)面坡面越陡峭，則紫果西番蓮葉多酚提取量受試驗(yàn)因素影響就越大，反之響應(yīng)面坡面越平緩，紫果西番蓮葉多酚提取量受試驗(yàn)因素影響就越小。圖中響應(yīng)面坡面陡峭順序?yàn)锳B＞AD＞AC＞BD＞BC＞CD，即液料比和提取時(shí)間交互作用響應(yīng)面最陡峭，表明液料比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量影響顯著，從等高線看液料比對(duì)多酚提取影響較大;而超聲功率和超聲溫度交互作用響應(yīng)面最平緩，表明超聲功率和超聲溫度的交互作用對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量影響不顯著，從等高線看超聲溫度對(duì)多酚提取的影響較小。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)Design－Expert V8.0.6軟件模型分析，預(yù)測(cè)紫果西番蓮葉多酚最佳提取工藝為:液料比35.97∶1 mL/g、提取時(shí)間54.19 min、超聲功率353.31 W和超聲溫度70.10℃，此時(shí)理論多酚提取量為13.3895 mg/g。根據(jù)實(shí)際操作設(shè)計(jì)紫果西番蓮葉中多酚提取條件為:液料比36∶1 mL/g、提取時(shí)間54 min、超聲功率350 W和超聲溫度70℃，按此工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得紫果西番蓮葉的平均多酚提取量為(13.19±0.17)mg/g，結(jié)果與預(yù)測(cè)的理論相近。表明模型擬合良好，參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and results of response surface methodology

2.3 紫果西番蓮葉多酚抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基活性 紫果西番蓮葉多酚對(duì)DPPH自由基的清除活性如圖6所示。由圖6可知，紫果西番蓮葉多酚具有一定的DPPH自由基清除能力。多酚對(duì)DPPH自由基清除率先隨著樣品濃度的增加而增大，濃度與活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，當(dāng)濃度為0.2 mg/mL后，多酚對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)82.25%，但明顯低于對(duì)照品維生素C的清除活性(95.41%)，經(jīng)Origin 8.0軟件擬合，紫果西番蓮葉多酚對(duì)DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)為0.058 mg/mL，對(duì)照品維生素C的半抑制濃度(IC50)為0.007 mg/mL。段宙位等［29］研究了沉香葉多酚類化合物清除DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)為0.106 mg/mL，表明紫果西番蓮葉多酚有較好的清除DPPH自由基能力。

表3 模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of model

圖5 各因素兩兩交互作用的對(duì)紫果西番蓮葉多酚提取量的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of the effect interaction between two factors of the extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

圖6 紫果西番蓮葉多酚對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.6 DPPH radicals scavenging activity of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.3.2 清除·OH活性 紫果西番蓮葉多酚對(duì)·OH的清除活性如圖7所示。由圖可知，紫果西番蓮葉多酚具有一定的·OH的清除能力:多酚對(duì)·OH清除率先隨著樣品濃度的增加而增大，濃度與活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，當(dāng)濃度低于0.8 mg/mL時(shí)，多酚對(duì)·OH清除率高于對(duì)照品維生素C;當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，多酚對(duì)·OH清除率達(dá)90.59%，與對(duì)照品維生素C的清除活性(90.89%)相當(dāng)，經(jīng)Origin 8.0軟件擬合，紫果西番蓮葉多酚對(duì)·OH的半抑制濃度(IC50)為0.144 mg/mL，對(duì)照品維生素C的半抑制濃度(IC50)為0.282 mg/mL。李南薇等［30］等研究了木瓜葉多酚清除·OH的半抑制濃度(IC50)為0.440 mg/mL，表明紫果西番蓮葉多酚有較好的清除·OH能力。

圖7 紫果西番蓮葉多酚對(duì)·OH清除作用Fig.7 Hydroxyl radicals scavenging activity of polyphenols from the purple passionfruit leaves

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取其多酚，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明:響應(yīng)面分析的二次模型是極顯著的，準(zhǔn)確性較高，液料比(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)及超聲溫度(D)等4個(gè)因素對(duì)多酚提取量影響順序?yàn)樘崛r(shí)間(B)＞液料比(A)＞超聲功率(C)＞超聲溫度(D)，其多酚提取最佳工藝:液液料比36∶1 mL/g、提取時(shí)間54 min、超聲功率350 W和超聲溫度70℃，此時(shí)紫果西番蓮葉多酚的提取量為(13.19±0.17)mg/g。并以清除DPPH自由基和·OH能力評(píng)價(jià)了紫果西番蓮葉多酚的抗氧化活性，其清除DPPH自由基、·OH的半抑制濃度(IC50)分別為0.058、0.144 mg/mL，表明紫果西番蓮葉多酚具有較好抗氧化活性，可作為潛在的天然抗氧化劑的來源應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。