李志剛，顧 陽(yáng)，陳寶峰，王寶石，張中華，常景玲，*

(1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453003;2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種生理活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的各種代謝活動(dòng)以及核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。該物質(zhì)在體內(nèi)可以促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗損傷、抗缺血和抗缺氧能力，臨床上主要用于心功能不全、心絞痛和心肌梗死等疾病的治療，另外，其作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品的生產(chǎn)中，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值［2－3］。

微生物合成cAMP代謝過(guò)程涉及糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、嘌呤核苷酸合成途徑、腺苷酸合成途徑和三羧酸循環(huán)，代謝流分配情況是影響cAMP合成的重要因素［4］。Chen等［5］利用不同的抑制劑調(diào)節(jié)糖酵解途徑代謝強(qiáng)度，結(jié)果表明氟化鈉顯著提高了cAMP的產(chǎn)量和得率。Niu等［6］利用13C示蹤實(shí)驗(yàn)對(duì)添加氟化鈉條件下的碳流分配情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明糖酵解途徑代謝強(qiáng)度明顯下降，同時(shí)磷酸戊糖途徑的代謝強(qiáng)度顯著上升。此外，Niu等［7］利用比較轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)高溶氧條件下cAMP產(chǎn)量顯著提高的原因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑中酶的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，而三羧酸循環(huán)和嘌呤核苷酸合成途徑中酶的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)量明顯上升。因此，合理調(diào)節(jié)碳流在糖酵解和磷酸戊糖途徑間的分配，能夠有效促進(jìn)cAMP的積累。

6－磷酸葡萄糖脫氫酶是改變碳流分配的關(guān)鍵酶，活性受NADPH的反饋抑制，消除過(guò)量的NADPH有利于碳流更多的分配到磷酸戊糖途徑［8］。硝酸鹽是一種氧化性強(qiáng)的氮源，在硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶順序催化作用下轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，同時(shí)該還原反應(yīng)需要NADPH作為輔酶才能進(jìn)行［9－10］。微生物利用硝酸鹽的過(guò)程會(huì)消耗大量NADPH，還原性輔酶NADPH水平下降會(huì)提高6－磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，還會(huì)影響其他代謝途徑中酶的活性，進(jìn)而改變代謝流分配情況［11－13］。

本文針對(duì)cAMP從頭合成途徑的代謝特點(diǎn)，通過(guò)適量添加硝酸鈉的方式促進(jìn)產(chǎn)物合成，并從cAMP發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、還原性輔酶水平、關(guān)鍵酶活性、胞內(nèi)氨基酸水平以及能量代謝水平等方面進(jìn)行研究，闡明硝酸鹽促進(jìn)cAMP發(fā)酵合成的生理機(jī)制，為硝酸鹽在核苷酸類產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)A.sp01 本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(保藏號(hào)為CCTCC No.M2013431);cAMP、ATP、AMP、NADH、NAD+分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司;苯酚、次氯酸鈉、水楊酸、對(duì)氨基苯磺酸、α－萘胺 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;6－磷酸葡萄糖脫氫酶試劑盒、NADPH與NADP+濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;AccQ－Tag氨基酸分析試劑包、氨基酸柱 沃特世科技(上海)有限公司(Waters);其他試劑 均為市售國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析級(jí)純。

LDZX－50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SW－CJ－2FD雙人垂直凈化工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造;ZWF－2112搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;UV－2800紫外分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;BIOTECH－7BG機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備有限公司;Aglient 1260 Infinity液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;VC150超聲波破碎儀 美國(guó)Sonics＆Materials公司;pH和DO電極 瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及配制參見文獻(xiàn)［14］。

1.2.2 培養(yǎng)方法

1.2.2.1 發(fā)酵罐培養(yǎng) 7 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐配備pH和DO電極各一支，裝載發(fā)酵培養(yǎng)基5 L(初始葡萄糖濃度為80 g/L)。121℃、高壓蒸汽滅菌20 min，接種量10%，發(fā)酵溫度30℃，初始pH調(diào)節(jié)至7.4待下降至6.8時(shí)保持不變，攪拌轉(zhuǎn)速初始400 r/min視溶氧變化情況逐漸增加至500 r/min，通風(fēng)量從起始的0.1 vvm提升至0.6 vvm。

1.2.2.2 硝酸鹽添加方法 發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn):發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行至24 h一次性添加3 g/L－broth的硝酸鈉。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn):設(shè)置1、2、3、4和5 g/L－broth等5個(gè)不同添加量和0、16、24和36 h等4個(gè)不同添加時(shí)間，共計(jì)20個(gè)不同組合，每個(gè)組合作3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 菌體濃度(OD600)和菌體干重(DCW)測(cè)定 菌體濃度采用光密度法測(cè)定，發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，所測(cè)數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)即為OD600;菌體干重通過(guò)關(guān)系式DCW(g/L)=0.46×OD600計(jì)算得出［15］。

全省濕地總面積2606萬(wàn)畝，有效維護(hù)生態(tài)平衡、保護(hù)生物多樣性。圖為“國(guó)際重要濕地”黃河三角洲國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。

1.2.3.2 葡萄糖濃度測(cè)定 采用DNS法進(jìn)行測(cè)定［15］。

1.2.3.3 cAMP與次黃嘌呤測(cè)定 使用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定［5］，取適量發(fā)酵液于離心管中，9000 r/min，離心10 min。上清液經(jīng)過(guò)0.45μm孔徑的水相膜過(guò)濾后待測(cè)。色譜條件:色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18柱(4.6 mm×300 mm，5μm)，進(jìn)樣量5μL，有機(jī)相為甲醇，水相為磷酸三乙胺緩沖液(0.6%的磷酸溶液，用三乙胺調(diào)p H為6.6)，水相與有機(jī)相體積比為70∶30，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)254 nm。

1.2.3.4 pH和CO2含量測(cè)定 p H由發(fā)酵罐配備的電極在線測(cè)定，尾氣中CO2含量由尾氣分析儀在線測(cè)定。

表1 硝酸鈉不同添加時(shí)間和添加量對(duì)cAMP發(fā)酵產(chǎn)物濃度的影響(g/L)Table 1 The effects of sodium nitrate on cAMP fermentation production with different addition time and amounts(g/L)

1.2.3.6 細(xì)胞內(nèi)ATP、AMP、NADH和NAD+濃度測(cè)定取5 mL發(fā)酵液，在4℃、9000 r/min條件下離心10 min。所得菌體于液氮中處理2 min，使細(xì)胞代謝瞬間停止。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，重新懸浮在5 mL的PBS緩沖液中，冰浴條件下超聲波破碎10 min，超聲3 s，停5 s。在4℃，12000 r/min條件下離心15 min，上清液用0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾后待測(cè)。ATP、AMP采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，具體方法參見文獻(xiàn)［15］;NADPH與NADP+濃度采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作方法和步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3.7 關(guān)鍵酶活性測(cè)定 6－磷酸葡萄糖脫氫酶活性采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作方法和步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行;異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和琥珀腺苷酸合成酶活性測(cè)定方法參見文獻(xiàn)［18］，比酶活以U/mg蛋白表示。

1.2.3.8 蛋白濃度測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定［18］。

1.2.3.9 胞內(nèi)氨基酸濃度測(cè)定 在不同發(fā)酵時(shí)期，分別取50 mL發(fā)酵液，12000×g離心10 min，使用超純水洗滌2次。細(xì)胞重懸于1 mL 10%(w/v)的三氯乙酸中，37℃放置10 min，煮沸15 min。12000×g離心10 min除去細(xì)胞碎片，上清經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后［19－20］，采用Waters公司開發(fā)的AccQ－Tag法進(jìn)行測(cè)定，操作方法和步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 硝酸鈉最佳添加時(shí)間與添加量的確定

在250 mL錐形瓶中進(jìn)行了添加硝酸鈉的cAMP發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)物濃度為指標(biāo)確定最佳添加時(shí)間和添加量。如表1所示，硝酸鈉添加量和添加時(shí)間對(duì)cAMP產(chǎn)量均有較為明顯的影響，24 h添加3 g/Lbroth硝酸鈉時(shí)cAMP濃度達(dá)到最高的3.58 g/L，比對(duì)照提高了36.6%，與其他組合條件相比具有顯著差異。因此，將24 h添加3 g/L－broth硝酸鈉確定為最佳操作條件，在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.2 硝酸鹽對(duì)7 L發(fā)酵罐中cAMP發(fā)酵性能的影響

在7 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐上進(jìn)行了添加硝酸鈉的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，添加時(shí)間為24 h，添加量為3 g/Lbroth，其它操作條件與對(duì)照批次一致。如圖1所示，添加硝酸鈉發(fā)酵批次的cAMP終產(chǎn)量達(dá)到5.02 g/L，比對(duì)照批次提高了22.7%，而葡萄糖消耗量有一定幅度的下降，cAMP對(duì)葡萄糖的得率達(dá)到了0.097 g/g，比對(duì)照提高了29.8%。在發(fā)酵中后期(36～60 h)，對(duì)照批次的產(chǎn)物合成速率明顯變慢，產(chǎn)物增加量很少，而添加硝酸鹽批次的產(chǎn)物合成仍較為活躍，合成量比對(duì)照批次高出約1.0 g/L，有效促進(jìn)了產(chǎn)物的合成與積累。這可能是由以下3個(gè)原因?qū)е碌?a.硝酸鈉作為一種氧化性氮源，利用過(guò)程消耗大量還原力(NADPH或NADH)，一定程度上影響了菌體的生長(zhǎng)和葡萄糖的利用;b.還原力的消耗緩解了NADPH對(duì)6－磷酸葡萄糖脫氫酶的反饋抑制，使碳流更多的分配到產(chǎn)物合成途徑;c.還原力的消耗致使副產(chǎn)物(乙酸和乳酸)合成大幅下降，從而提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。由圖1C可知，兩批次中pH均呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，在36 h后添加硝酸鹽批次的pH回升速度明顯快于對(duì)照批次，有機(jī)酸合成量減少和堿性物質(zhì)生成導(dǎo)致p H的迅速回升。添加硝酸鹽批次尾氣中CO2比例明顯高于對(duì)照批次(圖1D)，表明菌體的代謝活性得到增強(qiáng)。

另外，兩批次中次黃嘌呤濃度在40 h后均降到0.2 g/L以下，且基本沒有變化，cAMP是通過(guò)從頭合成途徑進(jìn)行合成的。cAMP的從頭合成途徑涉及到糖酵解與磷酸戊糖途徑間的碳流分配、能量供應(yīng)以及氨基酸供應(yīng)等問(wèn)題，因此，可以從硝酸鹽利用、代謝途徑關(guān)鍵酶活性水平、輔因子和ATP變化規(guī)律、氨基酸代謝等方面闡明硝酸鹽促進(jìn)cAMP合成的生理機(jī)制。

2.3 硝酸鹽對(duì)氮代謝和細(xì)胞內(nèi)還原性輔酶水平的影響

圖1 添加硝酸鈉對(duì)cAMP發(fā)酵性能的影響Fig.1 The effect of sodium nitrate on cAMP fermentation performance

硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶必須要有還原型輔酶(NADH或NADPH)提供還原力才能完成催化反應(yīng)，因此，對(duì)反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的NADH/NAD+和NADPH/NADP+進(jìn)行測(cè)定。如圖3所示，添加硝酸鹽批次細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+明顯高于對(duì)照批次的，而NADPH/NADP+卻明顯低于對(duì)照批次的，表明上述兩種還原酶主要以NADPH作為輔酶來(lái)還提供原力，而NADH/NAD+的提高表明細(xì)胞能量代謝得到強(qiáng)化。這也解釋了添加硝酸鹽批次呼吸代謝旺盛而菌體濃度較低的現(xiàn)象，NADPH/NADP+的大幅降低，使細(xì)胞組分的合成受到影響，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)。

2.4 硝酸鹽對(duì)cAMP合成途徑中關(guān)鍵酶活性的影響

微生物合成cAMP過(guò)程涉及到糖酵解、磷酸戊糖途徑、嘌呤核苷酸合成途徑以及三羧酸循環(huán)等。代謝流在不同途徑間的分配對(duì)產(chǎn)物合成具有顯著影響，而代謝網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處酶活性變化反映了代謝途徑的強(qiáng)弱和碳流分配情況。

圖2 添加硝酸鈉時(shí)cAMP發(fā)酵液中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的變化情況Fig.2 Time courses ofand concentrations in fermentation with sodium nitrate added

如圖4所示，添加硝酸鹽批次的丙酮酸脫氫酶活性比對(duì)照批次有一定程度下降，糖酵解途徑的代謝強(qiáng)度弱化;而異檸檬酸脫氫酶、6－磷酸葡萄糖脫氫酶和琥珀腺苷酸合成酶的活性均一定程度上高于對(duì)照批次，表明代謝流更多的分配到磷酸戊糖途徑為產(chǎn)物合成提供碳骨架，同時(shí)三羧酸循環(huán)的代謝強(qiáng)度也得到強(qiáng)化。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)高NADPH/NADP+水平會(huì)抑制6－磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，本文中硝酸鈉利用過(guò)程以NADPH為輔酶，使胞內(nèi)NADPH/NADP+水平顯著下降，解除或緩解了對(duì)6－磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制作用，提高了該酶的活性，進(jìn)而將更多的碳流分配到磷酸戊糖途徑為產(chǎn)物合成提供碳骨架，促進(jìn)了產(chǎn)物的合成。

圖3 硝酸鈉對(duì)胞內(nèi)氧化還原水平的影響Fig.3 The effects of sodium nitrate on NADPH/NADP+and NADH/NAD+

圖4 硝酸鹽對(duì)cAMP發(fā)酵代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的影響Fig.4 The effects of sodium nitrate on the activities of sAMPase，PGH，ICDH and G6PD

2.5 硝酸鹽對(duì)c AMP發(fā)酵過(guò)程中氨基酸合成的影響

對(duì)添加硝酸鈉發(fā)酵批次的細(xì)胞內(nèi)氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，添加硝酸鹽批次中有12種氨基酸的含量高于對(duì)照批次，其中6種氨基酸含量得到明顯提高，分別是天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和異亮氨酸(圖5)。天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸是微生物通過(guò)從頭合成途徑進(jìn)行cAMP合成的前體氨基酸，能夠部分或整體的整合到嘌呤環(huán)上，是產(chǎn)物合成的材料來(lái)源;同時(shí)天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和精氨酸均是以三羧酸循環(huán)的代謝物為碳骨架進(jìn)行合成的。硝酸鹽的利用不僅為氨基酸合成提供了氮素，還通過(guò)強(qiáng)化三羧酸循環(huán)提供了碳骨架，促進(jìn)了氨基酸代謝，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)物合成。

圖5 硝酸鹽對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨基酸合成的影響Fig.5 The effects of sodium nitrate on the amounts of intracellular amino acids

2.6 硝酸鹽對(duì)cAMP合成過(guò)程中能量代謝的影響

cAMP是由ATP在腺苷酸環(huán)化酶的催化下合成的，高ATP水平有利于產(chǎn)物的合成;而ATP/AMP則一定程度上體現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平和ATP合成水平。如圖6所示，添加硝酸鹽發(fā)酵批次的細(xì)胞內(nèi)ATP含量和ATP/AMP均明顯高于對(duì)照批次，結(jié)合NADH/NAD+的提高，表明硝酸鹽能夠強(qiáng)化能量代謝，有利于胞內(nèi)ATP的合成。

圖6 硝酸鹽對(duì)胞內(nèi)ATP含量和ATP/AMP比的影響Fig.6 The effects of sodium nitrate on intracellular ATP concentration and ATP/AMP

3 結(jié)論

發(fā)酵24 h添加3 g/L－broth硝酸鈉時(shí)，cAMP發(fā)酵性能得到明顯提升。硝酸鹽利用過(guò)程消耗了大量NADPH，緩解了對(duì)6－磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制作用，同時(shí)糖酵解途徑受到抑制而磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶活性明顯提高，更多碳流分配到產(chǎn)物合成途徑。此外，胞內(nèi)前體氨基酸水平、NADH/NAD+和ATP/AMP均得到明顯提高，為cAMP的發(fā)酵合成與積累提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。硝酸鹽利用過(guò)程消耗了大量的還原力，改變了代謝流分配情況，提高了胞內(nèi)氨基酸水平和ATP合成，為cAMP發(fā)酵合成提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。硝酸鹽作用機(jī)制的闡明，為提高核苷酸類發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)水平提供了參考。