齊紅，于姍姍，李敏，張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗檢測中心，濟(jì)南 250102）

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物的干燥全草，夏、秋二季采收，具有清熱解毒，利水消腫，活血止痛等功效，用于肺熱咳喘，腸癰、扁桃體炎，咽喉炎，小便不利等癥，外用可治瘡癤癰腫和毒蛇咬傷等［1］。白花蛇舌草始載于《潮州志》，其花白色，葉似蛇舌?！扒o、葉榨汁飲服，治盲腸炎，又可治一切腸病”。產(chǎn)于廣東、香港、廣西、海南、安徽、云南等省區(qū)，多見于水田、田埂和濕潤的曠地［2］。白花蛇舌草為民間常用中草藥，廣東、廣西、上海、山東和江蘇等省市（自治區(qū)）的地方標(biāo)準(zhǔn)中有收載，《中國藥典》2020年版一部收載了17種含白花蛇舌草的復(fù)方制劑［3］。

白花蛇舌草含有環(huán)烯醚萜類、三萜類、蒽醌類、黃酮類、有機(jī)酸類、甾醇類以及苯丙素類等活性成分［4–6］，還含有錫、錳、鋅、鍶、鉻等微量元素［7］?，F(xiàn)代藥理研究已證實白花蛇舌草可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒［8–9］等作用。目前，白花蛇舌草質(zhì)量控制研究集中在萜類成分齊墩果酸、熊果酸［10–13］和對香豆酸［14–16］的含量測定，其它成分如蘆丁、槲皮素［17］、去乙酰車葉草酸甲酯［18］、6-O-對香豆酰雞屎藤苷甲酯［19］等亦有報道，但同時測定白花蛇舌草中對香豆酸和蘆丁還未見報道。對香豆酸為酚酸類成分，蘆丁為黃酮類成分，兩者均具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［20］。

筆者在前人研究的基礎(chǔ)上建立了高效液相色譜（HPLC）法同時測定白花蛇舌草中對香豆酸和蘆丁含量，該方法準(zhǔn)確度高、分離度好、操作簡單，并對12批白花蛇舌草飲片中對香豆酸和蘆丁的含量進(jìn)行了測定和比較，為白花蛇舌草飲片的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–20AT型，二極管陣列檢測器，LCsolution工作站，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。

對香豆酸對照品：批號為112037–201801，以99.3%計，中國食品藥品檢定研究院。

蘆丁對照品：批號為100080–201811，以91.7%計，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

實驗用水為純凈水。

實驗用其余試劑均為分析純。

白花蛇舌草飲片樣品：均為茜草科植物白花蛇舌草，樣品編號及來源見表1。

表1 樣品信息

1.2 HPLC色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，瑞典Nouryon公司）；流動相：甲醇–0.1%磷酸溶液（體積比為30∶70）；檢測波長：308 nm（對香豆酸）、353 nm（蘆?。?；流量：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。對照品溶液色譜圖見圖1、圖2。

圖1 308 nm波長下對照品溶液色譜圖

圖2 353 nm波長下對照品溶液色譜圖

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取對香豆酸對照品10.62 mg、蘆丁對照品9.09 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，制得對照品貯備液，取對香豆酸對照品貯備溶液1 mL、蘆丁對照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得，對香豆酸、蘆丁質(zhì)量濃度分別為10.55、41.68μg／mL。

1.4 樣品溶液的制備

取白花蛇舌草粉末（過3號篩）約1.0 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的考察

以編號為6的白花蛇舌草樣品為待測對象，進(jìn)行了提取溶劑、提取方法和提取時間的考察。分別選擇甲醇、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液3種提取溶劑對對香豆酸和蘆丁進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時，色譜峰峰面積較大，峰形較好，基線平穩(wěn)，故采用甲醇為提取溶劑。

以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲法、回流法、索氏提取法對對香豆酸和蘆丁進(jìn)行提取，結(jié)果表明，3種提取方法的色譜峰峰面積接近，超聲法操作簡單，故選用超聲法對樣品進(jìn)行提取。

考察超聲時間分別為20、30、60 min時的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min時，提取較完全，故選擇超聲時間為40 min。

2.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長下進(jìn)行掃描，采集光譜圖，對香豆酸和蘆丁的光譜圖分別見圖3、圖4。由圖3、圖4可見，對香豆酸在308 nm處有最大吸收，蘆丁在254、353 nm下均有最大吸收，但在353 nm下蘆丁的基線更平穩(wěn)，因此選擇對香豆酸、蘆丁的檢測波長分別為308、353 nm

圖3 對香豆酸光譜圖

圖4 蘆丁光譜圖

2.3 色譜條件的考察

改變色譜條件對白花蛇舌草樣品溶液進(jìn)行分析，來考察色譜條件變化對測定結(jié)果的影響。色譜條件變化如下：

（1）對3種流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，分別為甲醇–水系統(tǒng)、甲醇–0.1%磷酸溶液系統(tǒng)和乙腈–0.1%磷酸溶液系統(tǒng)，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇–0.1%磷酸溶液（體積比為30∶70）作流動相時，色譜峰的分離效果較好，且基線較為平穩(wěn)。

（2）將流動相流量分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL／min，當(dāng)流量設(shè)定為1.0 mL／min時，色譜峰分離效果較好，峰形較好。

（3）柱溫分別設(shè)置為25、30、35 ℃，色譜峰分離效果均較好，為便于操作，柱溫選擇30 ℃。

（4）分別選用SHIMADZU VP–ODS C18（250 mm ×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱和Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱，色譜峰分離效果均較好。實驗選擇Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）型色譜柱。

2.4 線性方程、線性范圍與檢出限

用自動進(jìn)樣器依次吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入色譜儀，測定峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。用甲醇逐級稀釋對照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定，以3倍信號和噪音（S／N）的比值對應(yīng)的溶液濃度作為方法檢出限。對香豆酸、蘆丁的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見表2。

表2 香豆酸、蘆丁的回歸方程和線性范圍

2.5 穩(wěn)定性試驗

取編號為6的白花蛇舌草樣品，按1.4方法制備樣品溶液，分別于制備完成后第0、2、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。由表3可知，對香豆酸和蘆丁峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.31%、0.91%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 精密度試驗

取編號為6的白花蛇舌草樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，按1.4方法制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果

由表4可知，對香豆酸和蘆丁的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.60%、1.16%，說明該方法精密度較好，能滿足測定要求。

2.7 回收試驗

精密稱取編號為6的白花蛇舌草樣品6份，每份約0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入對香豆酸對照品貯備液1 mL、蘆丁對照品貯備液5 mL，按1.4項下方法制成樣品溶液。在1.2色譜條件下測定，分別計算對香豆酸和蘆丁的加樣回收率，結(jié)果見表5。加標(biāo)樣品溶液色譜圖見圖5、圖6。由表5可知，對香豆酸和蘆丁平均回收率分別為94.01%、91.05%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.90%、1.45%（n=6），說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 對香豆酸、蘆丁的加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=6）

圖5 308 nm波長下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

圖6 353 nm波長下加標(biāo)樣品溶液色譜圖

2.9 樣品測定

分別取編號為1～12的白花蛇舌草粉末各約1.0 g，精密稱定，按1.4項下方法制成樣品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表6。由表6可知，不同產(chǎn)地樣品中對香豆酸和蘆丁的含量差異較大，其中蘆丁含量均高于對香豆酸含量。

3 結(jié)語

建立了HPLC法同時測定白花蛇舌草中的對香豆酸和蘆丁兩種化合物含量的方法，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，簡便易行，可用于白花蛇舌草藥材的質(zhì)量控制和評價。

表6 樣品中對香豆酸、蘆丁含量測定結(jié)果 mg／g