范 珺

（濰坊市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濰坊 261000）

1 前言

磺胺類藥物自發(fā)現(xiàn)至今，已有80余年歷史。由于其具有廣譜抗菌性、性質(zhì)穩(wěn)定、吸收快、使用方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在醫(yī)療衛(wèi)生、食品生產(chǎn)、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但在使用過(guò)程中也存在著一些缺陷，例如抑菌效果弱、易產(chǎn)生耐藥性、用量大、療程長(zhǎng)和發(fā)生不良反應(yīng)等，這些缺陷的存在會(huì)造成磺胺類藥物的過(guò)量使用，由此導(dǎo)致水產(chǎn)、畜禽肉等農(nóng)產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)，對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅。

隨著檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于磺胺類藥物的檢測(cè)方法已從最初的一種變?yōu)楝F(xiàn)在的多種，主要包括LC-MS（高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法）、LC（高效液相色譜法）、快速檢測(cè)法（ELISA酶聯(lián)免疫吸附法）、安培檢測(cè)法等。其中LC-MS和LC最為常用，在定性定量方面占有很大優(yōu)勢(shì)。本研究以水產(chǎn)品為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過(guò)一系列條件的優(yōu)化，建立了關(guān)于磺胺類藥物的高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

甲酸（色譜純，賽默飛世爾），甲醇、乙腈（色譜純，默克），Captive EMR柱（5982-1003，安捷倫），7種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/ml，Dr.Ehrenstorfer GmbH）。0.1%甲酸-水溶液：甲酸：水=1：1000。

超高效液相色譜（1290）-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（6495）（美國(guó)，安捷倫）；CF16RN高速冷凍離心機(jī)（日本，日立）；渦旋混合器（德國(guó)，IKA）；MS2204TS電子天平（瑞士，梅特勒）。

樣品為市售魚類，取可食部分進(jìn)行均勻碎樣作為待測(cè)樣品。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取0.1mL的100μg/mL磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線，得到濃度為1ug/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，冷藏保存。

準(zhǔn)確量取1mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容后得到濃度為100ng/mL的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品工作液，冷藏保存。分別吸取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL的上述工作液于10mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容，即得到濃度分別為1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列工作液。

2.3 樣品前處理

待測(cè)樣品經(jīng)充分均質(zhì)后，稱取5.0g于離心管中，加入2ml水以3000r/min轉(zhuǎn)速渦旋1min。然后加入10mL乙腈，4.0g無(wú)水硫酸鈉和1.0g氯化鈉，劇烈震蕩1min，靜置10min，于4℃以9000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。取出2.4mL上清液，加0.6mL水，以2000r/min轉(zhuǎn)速渦旋1min，混合液過(guò)Captive EMR柱，重力自流。收集流出液過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，作為待測(cè)樣液。

2.4 儀器條件

2.4.1 超高效液相色譜條件。色譜柱：ZORBAX SB-C18（3.0×100mm，1.8-Micron）；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：2μL；流速：0.4mL/min。流動(dòng)相組成：A 為0.1%甲酸-水溶液，B純甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：AJS ESI源；離子模式：正離子模式；毛細(xì)管電壓：3500V；噴嘴電壓：0V；霧化氣壓力：30psi；干燥氣溫度：150℃；干燥氣流速：15L/min；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；監(jiān)測(cè)模式：MRM模式（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）。待測(cè)磺胺類藥物的具體離子參數(shù)見表2。

表2 7種磺胺類藥物的MRM采集參數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量的依據(jù)是建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將事先配置好的一系列工作液按相同的儀器條件進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，利用得到的響應(yīng)值和對(duì)應(yīng)的溶液濃度即可建立線性方程。依照1.4中設(shè)定的儀器條件進(jìn)行磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，各目標(biāo)物的線性方程和相關(guān)系數(shù)R2見表3。標(biāo)準(zhǔn)溶液的磺胺類藥物MRM色譜圖見圖1。

圖1 2ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中7種磺胺類藥物的MRM色譜圖

從表3可知，由安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀建立的各磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好線性，相關(guān)系數(shù)R2在0.9981～0.9999之間，說(shuō)明建立的儀器條件和采集方法是合適的，可以準(zhǔn)確對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量測(cè)定。并且各化合物的出峰時(shí)間相差較大，峰形沒(méi)有重疊（見圖1），說(shuō)明色譜柱分離效果好，可以將磺胺類混合物完全分開，使定性定量更加準(zhǔn)確。

方法檢出限指分析方法在適當(dāng)置信水平內(nèi)，能從樣品中檢測(cè)被測(cè)組分的最小量或最小濃度，是表征分析方法的重要參數(shù)之一。表3顯示7種磺胺類藥物的檢出限低至1.0ug/kg，可見建立的前處理方法和檢測(cè)方法具有很高的靈敏度，對(duì)于檢測(cè)水產(chǎn)品中的磺胺來(lái)說(shuō)有效可行。

表3 7種磺胺類藥物殘留的線性方程和儀器檢出限

3.2 方法回收率的確定

樣品經(jīng)過(guò)前處理后，待分析物質(zhì)通常會(huì)發(fā)生損失。為了檢驗(yàn)樣品處理方法的適宜性和人員操作誤差等因素，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置質(zhì)控樣品用來(lái)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度，回收率計(jì)算是一種常用的有效方法。

稱取5.0g樣品，加入25uL 1ug/mL的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，使其添加水平為5ug/kg。待與樣品充分混勻后，按照和空白樣品相同的處理過(guò)程進(jìn)行，用得到的提取液上機(jī)測(cè)定，其回收率見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)添加水平下7種磺胺類藥物的回收率

從表4可知，在5ug/kg的添加水平下，7種磺胺類藥物的回收率范圍為83%～95%，其中磺胺嘧啶的加標(biāo)回收率最低，為83.4%；磺胺喹惡啉的加標(biāo)回收率最高，為94.2%；其余磺胺化合物的回收率處于兩者之間。由于樣品自身含有的7種磺胺類藥物含量均低于檢出限1ug/kg，根據(jù)GB/T27404-2008標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)回收率的要求，當(dāng)被測(cè)組分的含量小于0.1mg/kg時(shí)，回收率在60%～120%之間即為合格，由此可以判定實(shí)驗(yàn)所用的前處理方法完全可以滿足檢測(cè)要求。

4 結(jié)論

本文以水產(chǎn)品為檢測(cè)樣品，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了其含有的7種磺胺類化合物的含量。利用本實(shí)驗(yàn)建立的測(cè)定方法可以在1ng/mL～20ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，7種磺胺藥物的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，說(shuō)明本方法可以準(zhǔn)確定量水產(chǎn)品中的該類藥物。同時(shí)該方法的檢出限為1ug/kg，該檢出限表明本方法可以用于水產(chǎn)品中痕量級(jí)別的磺胺類藥物殘留檢測(cè)，具有更高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)于保證產(chǎn)品安全十分有效。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還驗(yàn)證了添加水平為5ug/kg時(shí)該方法的回收率，結(jié)果顯示各類藥物的回收率均大于80%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以滿足檢測(cè)要求。LC-MS方法的建立有助于提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率和檢測(cè)水平，嚴(yán)格把控水產(chǎn)品類食品的質(zhì)量安全，保證消費(fèi)者權(quán)益。