任 慧，陳秀珍，張 娟，牛會忠，耿建磊，趙天嬌

(1. 河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050000；2. 河北省優(yōu)撫醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

肝母細胞瘤是一種胚胎性腫瘤，由肝細胞前體細胞產(chǎn)生并再現(xiàn)了肝臟發(fā)育的各個階段，是兒童期最為常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤[1]。近年來隨著新輔助化療、輔助化療的應(yīng)用及手術(shù)技術(shù)、肝移植技術(shù)的成熟，肝母細胞瘤患兒的5年總體存活率有了明顯提高，但因為其發(fā)病機制及分子生物學(xué)機制尚未完全闡明，復(fù)發(fā)后的治療及肝移植的相關(guān)治療仍是肝母細胞瘤治療的難點[2]。既往研究顯示，CTNB1、CAPR2等基因突變導(dǎo)致的Wnt/β-catenin激活是誘導(dǎo)細胞增殖、存活、遷移和侵襲的重要途徑和肝母細胞瘤發(fā)病的重要機制[3]。在小鼠模型中單獨表達完整的β-catenin不足以引起肝母細胞瘤的發(fā)生，激活Yes相關(guān)蛋白(YAP)和β-catenin共同表達可導(dǎo)致實驗動物體內(nèi)肝母細胞瘤形成，提示YAP可能作為第二信使與β-catenin共同促進肝母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展，但YAP促進肝母細胞瘤形成的分子機制尚未闡明[4]。哺乳動物雷帕霉素(RAPA)靶蛋白(mTOR)是非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導(dǎo)的信號通路對細胞的生長及生存具有重要調(diào)節(jié)作用，隨著對mTOR研究的深入，發(fā)現(xiàn)其與衰老、腫瘤、糖尿病等疾病均存在相關(guān)性，YAP通路可激活mTOR信號通路，調(diào)控細胞生長，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。本研究通過過表達人肝母細胞瘤HepG2細胞YAP/TAZ和RAPA抑制mTORC1共同探討mTORC1在肝母細胞瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，為針對mTOR的靶向治療提供理論和實驗依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株 人肝母細胞瘤細胞株HepG2購自中科院上海細胞生物所，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱培養(yǎng)，細胞經(jīng)0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行培養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器 pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒、空白質(zhì)粒由大連寶生物工程公司合成；RAPA購自武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司，純度99%，貨號：llb5458996；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自維森特生物技術(shù)(中國)有限公司；Xfecttm轉(zhuǎn)染試劑、ABI7300熒光定量PCR儀、實時熒光PCR試劑盒購自賽默飛世爾；MTT購自上海源葉生物科技有限公司；Transwell小室購自上海子起生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1細胞分組與轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化后調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板，細胞融合度達50%～80%時，分為空白試劑組、空白質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組，使用XfectTM轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染空白試劑、空白質(zhì)粒、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒。

1.3.2實時熒光定量PCR法檢測YAP和TAZ mRNA表達 按1.3.1方法轉(zhuǎn)染后24 h，收集各組細胞，用RNAiso Plus提取細胞總RNA，檢測RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，用SYBR-PCR試劑盒檢測YAP和TAZ mRNA水平，ABI7300熒光定量PCR儀溶解曲線采集，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列：YAP上游為5’-CAGCTTCTCTGCAGTTGGGA-3’，下游為5’-TCATGGCAAAACGAGGGTCA-3’；TAZ 上游為5’-TGGACCAAGTACATGAACCACC-3’,下游為5’-CTCCACAGCCGACTTGTTCT-3’；GAPDH 上游為5’-GGCTGCCCAGAACATCAT-3’，下游為5’-CGGACACATTGGGGGTAG-3’。

1.3.3MTT法檢測HepG2細胞增殖活性 按1.3.1方法轉(zhuǎn)染后12 h，空白試劑組、空白質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組給予含100nmol/L的RAPA培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT10μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，加入Formanzan溶解液100μL，搖床上低速振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后在酶標儀490 nm處測定吸光度。

1.3.4Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力按1.3.1方法轉(zhuǎn)染后12 h，空白試劑組、空白質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組給予含100 nmol/L的RAPA培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，取各組細胞以3×104/孔密度接種于Traanswell小室中，將含5%FBS的培養(yǎng)基添加到Transwell小室下室，侵襲試驗Tranwell小室預(yù)先涂基質(zhì)膠，遷移試驗Transwell小室不涂基質(zhì)膠，將細胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，采用Diff Quik溶液染色，光鏡下隨機選取5個視野的侵襲、遷移細胞進行計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞中YAP/TAZ mRNA表達量比較 空白試劑組和空白質(zhì)粒組YAP、TAZ mRNA表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組和pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組YAP、TAZ mRNA表達量均明顯高于空白試劑組和空白質(zhì)粒組(P均<0.05)，但pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組和pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組HepG2細胞中YAP/YAZ mRNA相對表達量比較

2.2各組HepG2細胞增殖活性比較 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組HepG2細胞增殖活性吸光度均明顯高于空白試劑組、空白質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組HepG2細胞培養(yǎng)不同時間增殖活性吸光度比較

2.3各組HepG2細胞遷移和侵襲能力比較 pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯多于空白試劑組、空白質(zhì)粒組、pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組HepG2細胞遷移和侵襲能力比較個)

3 討 論

兒童肝臟惡性腫瘤約占全身惡性腫瘤的1%，其中肝母細胞瘤約占兒童肝臟原發(fā)惡性腫瘤的80%，目前全球發(fā)病已從1.2/100萬上升至1.5/100萬，是兒童最常見的惡性腫瘤[4]。10%～20%的肝母細胞瘤患者易轉(zhuǎn)移至肺、肝門、腦和骨，雖然標準化療、手術(shù)技術(shù)取得了長足的進展，存活率有了明顯提高，但總體預(yù)后仍不理想[5]。目前肝母細胞瘤尚無廣泛公認的基因靶標和完善的分子分型[6]，其具體病因及發(fā)病機制尚不明確，其治療手段仍有待完善。

肝母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移涉及多個基因的變異，最常發(fā)生的基因變異位點位于Wnt信號通路[7]。近年來的研究顯示，YAP是肝母細胞瘤發(fā)生的另一關(guān)鍵因素，在肝母細胞瘤患者中存在激活，β-catenin和YAP共同激活才能導(dǎo)致實驗動物肝母細胞瘤產(chǎn)生，YAP或β連環(huán)蛋白沉默均可導(dǎo)致肝母細胞瘤增殖減少[8-9]，但YAP促進肝母細胞瘤發(fā)育的確切機制目前尚不明確。Hippo/YAP通路可與體內(nèi)多個信號通路協(xié)同發(fā)揮作用，其可激活mTOR信號通路，mTOR通路是調(diào)節(jié)細胞生長和代謝的主要信號靶點，靶向mTOR途徑是治療多種腫瘤的有效方法[10-11]。Hartmann等[12]對24例肝母細胞瘤患兒的研究顯示，96%的患兒血清中檢測到p-mTOR表達。Tao等[13]及Li等[14]研究顯示，73%～85%的肝母細胞瘤患兒YAP高表達，高于YAP在肝細胞肝癌中的陽性表達率，YAP和β-catenin共活化僅見于肝母細胞瘤，在原發(fā)性肝癌中未發(fā)現(xiàn)二者共激活。

本實驗結(jié)果顯示，人肝母細胞瘤細胞株HepG2轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒，過表達YAP/TAZ可增加YAP/TAZ mRNA表達，HepG2細胞YAP/TAZ途徑被過度激活。對細胞增殖、遷移和侵襲能力的研究顯示，pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組HepG2細胞增殖能力、遷移能力和侵襲能力均顯著增強，提示增強YAP/TAZ信號通路可增加HepG2細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。RAPA是最早發(fā)現(xiàn)的mTOR抑制劑，可與FKBP12結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物再和mTOR的FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可特異性抑制mTORC1活性[15]。本實驗結(jié)果顯示，pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組和pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組YAP/TAZ mRNA表達量相近，但pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒+RAPA組HepG2細胞增殖、遷移和侵襲活性均低于pcDNA3.1-YAP/TAZ質(zhì)粒組，因為RAPA的作用靶點為mTORC1，提示YAP/TAZ參與肝母細胞瘤發(fā)展的過程中需要mTORC1參與。

綜上所述，激活mTORC1可能是YAP/TAZ信號通路參與肝母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的重要途徑，針對mTORC1的靶向治療可能在肝母細胞瘤治療中具有重要前景。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。