李祥昀，侯夢園，李培培，劉艷菊

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046

槐米又名白槐、槐花，是豆科植物槐的干燥花蕾?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，其藥性苦，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、清肝瀉火等功效。槐米中主要活性成分為黃酮類物質(zhì)，如蘆丁、槲皮素等。槲皮素作為黃酮醇類代表性化合物，具有很高的藥用價值，能夠抗癌［1－3］、抗炎［4－5］、抗病毒［6］、保護心腦血管［7］、抗氧化［8］和抑制黑色素生成［9］。因此，快速、準確測定槐米中槲皮素的含量具有重要意義。文獻報道槲皮素含量測定的方法主要有高效液相色譜法［10－13］、化學(xué)修飾電極法［14］、薄層掃描色譜法［15］、高效毛細管電泳法［16］等。熒光分光光度法因具有簡便、快速、專屬性好等特點得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，基于還原態(tài)DES（4，4′－二疊氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二鈉四水合物）的熒光特性，利用熒光分光光度法測定槐米中槲皮素含量的研究未見報道。

前期研究發(fā)現(xiàn)DES自身沒有熒光，但其還原產(chǎn)物具有較強的熒光發(fā)射。槐米中的活性成分槲皮素具有較強的抗氧化能力，可以還原DES，生成還原態(tài)DES，發(fā)出較強的熒光。本研究通過改變?nèi)芤旱膒H值、槲皮素濃度及槲皮素與DES反應(yīng)的時間等條件，對該方法的檢測性能進行分析，建立一種簡單、準確、快速定量檢測槲皮素的熒光分光光度法，可用于槐米中槲皮素含量的檢測，為槐米的綜合開發(fā)及臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

FLS 1000熒光分光光度計（Edinburgh公司，英國），超純水儀（默克化工技術(shù)有限公司，上海）。

槐米購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房（產(chǎn)地：安徽亳州，批號：190601），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院謝小龍博士鑒定為豆科植物槐的干燥花蕾。槲皮素對照品（批號：150803），購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。DES（4，4′－二疊氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二鈉四水合物），購自阿拉丁試劑有限公司。三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取槲皮素對照品適量，用體積分數(shù)70%乙醇溶液溶解，得到4 mmol·L－1的槲皮素對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備取槐米粉末4 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入體積分數(shù)80%乙醇100 mL。水浴加熱至87℃，保持微沸回流120 min后趁熱過濾，然后用體積分數(shù)80%乙醇定容至100 mL，即得［17－19］。

2.3 檢測方法取4 mmol·L－1槲皮素對照品溶液20μL和DES（15 mmol·L－1）溶液50μL，室溫反應(yīng)5 min后，加入530μL Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）緩沖溶液，在激發(fā)波長（Ex）為383 nm，狹縫寬度2 nm的條件下，測試溶液的熒光發(fā)射光譜。

2.4 可行性分析以Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）溶液為參比溶液，試驗組溶液為：①槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（530μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；②槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋Tris－HCl（580μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；③DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（550μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）。使用2.3項下的方法，測試上述3種混合溶液的熒光發(fā)射光譜。實驗結(jié)果如圖1所示，槲皮素、DES溶液均未有明顯的熒光發(fā)射，而槲皮素和DES的混合溶液具有較強的熒光信號，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是DES的共軛結(jié)構(gòu)兩端吸電子性的疊氮基被還原為給電子性的氨基，氨基的給電子能力提高了分子的最高占有軌道能級，能級間隙減小，使得溶液在紫外光照射下發(fā)出強烈的熒光［20］。因此基于槲皮素的抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性所建立的槲皮素含量測定方法是可行的。

圖1 可行性實驗的熒光光譜圖

2.5 條件優(yōu)化

2.5.1 pH值優(yōu)化槲皮素結(jié)構(gòu)受pH值影響較大，在強酸強堿條件下其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變［21］。在pH為4、5、6、7、8、9的條件下，分別測定反應(yīng)體系的熒光強度。如圖2－A所示，pH值從4至6時溶液熒光強度逐漸增大，在pH＝6時溶液的熒光發(fā)射強度達到最大，當pH值超過6時熒光強度逐漸減弱。因此選擇pH＝6的緩沖溶液進行熒光測定。

2.5.2 時間優(yōu)化測試槲皮素和DES在反應(yīng)時間為5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min時溶液的熒光強度。如圖2－B所示，實驗結(jié)果表明混合溶液熒光強度在5～30 min內(nèi)幾乎不隨反應(yīng)時間而變化。選擇槲皮素與DES反應(yīng)5 min后測試溶液的熒光光譜。

3 槐米中槲皮素的含量測定

3.1 線性關(guān)系考察精密稱取槲皮素對照品適量，用體積分數(shù)70%乙醇溶解，配制0.25 mmol·L－1、0.5 mmol·L－1、0.75 mmol·L－1、1.00 mmol·L－1、2.00 mmol·L－1、4.00 mmol·L－1的槲皮素對照品溶液。根據(jù)2.3項下方法測試熒光光譜。實驗結(jié)果表明，槲皮素濃度為0.25～4.00 mmol·L－1的范圍內(nèi)，溶液的熒光發(fā)射強度與槲皮素濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為Y＝104 119.79 X＋84 927.823（X代表槲皮素濃度的對數(shù)值，Y代表DES還原產(chǎn)物的熒光強度），R2＝0.999 6。見圖3。

圖2 槲皮素測試條件優(yōu)化的熒光光譜圖

圖3 不同槲皮素溶液濃度對應(yīng)的熒光強度

3.2 共存物質(zhì)的影響常見的金屬陽離子、銨根離子以及Glc（葡萄糖）可能會影響槲皮素檢測的準確性［22］。實驗結(jié)果表明在槲皮素濃度為1.00 mmol·L－1條件下，50倍濃度的K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋、NH4＋以及Glc對反應(yīng)體系的熒光強度沒有明顯影響，表明該方法的選擇性良好。見圖4。

3.3 重復(fù)性實驗取5份槐米樣品，根據(jù)2.2項下的方法制備供試品溶液，按照2.3項下的方法進行熒光檢測。根據(jù)對照品線性回歸方程，得到樣品中槲皮素含量的平均值為0.1325 mg·g－1，RSD為2.2%，表明測定方法的重復(fù)性較好。

3.4 加樣回收率實驗取9份已知含量（槲皮素0.132 5 mg·g－1）的槐米粗粉，3份一組，分別按照0.8倍、1.0倍、1.2倍加樣量加入槲皮素對照品，按照2.2項下的方法制備待測樣品溶液。按照2.3項下的方法測定溶液的熒光強度，并根據(jù)線性方程計算出槲皮素含量的理論值，結(jié)果列于表1。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)得到槲皮素的平均回收率為98.47%，相對標準偏差（RSD）為5.51%（n＝9）。實驗結(jié)果表明，該方法符合定量分析的要求。

圖4 共存物質(zhì)對檢測結(jié)果影響的熒光光譜圖

表1 加樣回收率實驗測試結(jié)果

4 結(jié)論

基于槲皮素的強抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性，對槐米中槲皮素含量進行測定。結(jié)果表明，體系的最佳pH值為6，在5～30 min內(nèi)槲皮素與DES混合溶液的熒光強度無明顯變化。在最佳條件下，槲皮素濃度為0.25～4.00 mmol·L－1時，槲皮素的濃度與還原態(tài)DES的熒光強度之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢測限為5.45×10－3mmol·L－1，R2＝0.999 6。常 見金屬離子（K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋），NH4＋和Glc對測定結(jié)果無明顯干擾。該方法操作簡便，具有良好的抗干擾性、重現(xiàn)性，可為槐米藥材質(zhì)量評價提供參考。