林利，郭婕，朱佳

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210000；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院，江蘇 南京210000

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸道疾病，臨床上以可逆性氣流受限和氣道高反應(yīng)性為主要表現(xiàn)。全球范圍內(nèi)哮喘患者總數(shù)超過3億［1］。近年來，哮喘患病率顯著上升［2］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，氣溫降低是誘發(fā)哮喘發(fā)作的常見環(huán)境因素［3］。哮喘患者的門診就診人數(shù)及住院率的增長常伴隨著冷風(fēng)過境、氣溫驟降等氣候變化［4－5］。目前，哮喘的臨床治療主要以糖皮質(zhì)激素和β受體激動劑等為主，可有效改善哮喘患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，但仍存在部分患者藥物不耐受、藥物不敏感、停藥后易復(fù)發(fā)、藥物不良反應(yīng)大、患者依從性差等問題［6］，哮喘控制的現(xiàn)狀不盡如人意。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，風(fēng)寒之邪引動伏痰而發(fā)哮喘屬于“冷哮證”的范疇，擬以祛風(fēng)化痰、扶正溫陽論治。研究表明，中西醫(yī)結(jié)合療法治療哮喘，在穩(wěn)定病情、減少發(fā)作次數(shù)、減輕藥物不良反應(yīng)等方面具有優(yōu)勢［7－8］。祛風(fēng)宣肺湯是由江蘇省名中醫(yī)朱佳教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合中醫(yī)藥治療哮喘的深刻認(rèn)識總結(jié)的而成，治療咳嗽變異性哮喘、變應(yīng)性咳嗽方面頗有療效。實驗證實，祛風(fēng)宣肺湯具有降低氣道高反應(yīng)性，減輕肺部炎性細(xì)胞浸潤，抑制肺組織神經(jīng)源性炎癥的作用［9－11］。本研究主要考察了祛風(fēng)宣肺湯對冷刺激聯(lián)合屋塵螨（house dust mite，HDM）誘導(dǎo)過敏性哮喘小鼠的干預(yù)機(jī)制。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性BALB／c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017－0005，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（蘇）2014－0001，溫度22～26℃，濕度50%～60%，自由進(jìn)食飲水。實驗設(shè)計和操作經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批，倫理批號：ACU190902。

1.2 藥物與試劑祛風(fēng)宣肺湯（紫蘇梗、炙麻黃、蟬蛻、半夏、佛耳草、白前、紫菀、百部、全蝎、南沙參、甘草，南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院中藥房）。HDM（美國Greer Laboratory公司，貨號：XPB70D3A25）；免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白細(xì)胞介素－5（interleukin－5，IL－5）、IL－13 ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號分別為：88－7237－88、88－7054－88、88－7137－88）；兔抗鼠受體電位M8亞型通道蛋白（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）多克隆抗體（美國Novus生物公司，貨號：NBPI－97311）。

1.3 儀器XSP－18B型光學(xué)顯微鏡（江南光電集團(tuán)股份有限公司）；Syne－Rgy2型Biostack Ready酶標(biāo)儀（美國Bio－Tek公司）；EG1150H型包埋儀（德國Leica公司）；Sorvall Legend Micro 17R型冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備將祛風(fēng)宣肺湯的中藥飲片加水浸泡后，煎煮2次，每次1 h，混合并過濾兩次藥液，濃煎后加純水定容至1.183 kg·L－1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠分組和模型建立將小鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、冷刺激組、HDM組、模型（冷刺激＋HDM）組、祛風(fēng)宣肺湯（11.83 g·kg－1）組，每組8只；造模方法在傳統(tǒng)方法［12］的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，HDM組、模型組和祛風(fēng)宣肺湯組分別于第0天、第7天、第14天腹腔注射HDM（0.5 g·L－1）100μL，并于第21至第23天連續(xù)3 d滴鼻HDM（2.5 g·L－1）50μL。

將小鼠放入自制的低溫箱內(nèi)，即PP材料鼠籠（32 cm×21 cm×17 cm），撤除墊料，將籠深埋在碎冰中1 h，籠內(nèi)溫度低于10℃，籠內(nèi)溫度控制在（10±3）℃。第21至第23天，模型組和祛風(fēng)宣肺湯組在滴鼻操作后與冷刺激組置于低溫箱30 min。祛風(fēng)宣肺湯組第0～24天每天給藥1次，給藥時間均在HDM處理前約30 min。每5天稱小鼠的體質(zhì)量，并調(diào)整劑量。

2.3 檢測外周嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）計數(shù)和血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）水平 最后一次滴鼻24 h后，麻醉小鼠，摘除眼球，收集血液，將20μL全血和380μL嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)液混勻滴于細(xì)胞計數(shù)板上，光鏡下觀察外周血EOS計數(shù)；剩余全血室溫靜置2 h，3 500 r·min－1離心15 min，取血清，用ELISA試劑盒檢測血清IgE水平。

2.4 檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的細(xì)胞因子小鼠脫頸處死，逐層分離頸胸部組織，暴露肺葉及頸部氣管，結(jié)扎左側(cè)肺葉，取1 mL的PBS灌洗右肺，收集BALF，4℃、1 000 r·min－1離心10 min，取上清液，－20℃保存。ELISA試劑盒檢測BALF中IL－5和IL－13水平。

2.5 肺組織病理和免疫組織化學(xué)每組隨機(jī)取3只小鼠，取左肺葉，保存于4%多聚甲醛中48 h，石蠟包埋、脫水、切片后進(jìn)行HE染色和免疫組化分析。光鏡下觀察組織病理學(xué)改變，顯微鏡下觀察靶蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)染色程度進(jìn)行半定量分析。以無染色計0，輕染計1，中染計2，強(qiáng)染計3，超強(qiáng)染計4［11］。分析操作由2名不參與本實驗的專業(yè)病理人員完成。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM），采用方差分析比較各組間的差異，Bonferroni檢驗進(jìn)行秩后比較分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 觀察小鼠的一般情況空白組、冷刺激組小鼠未出現(xiàn)明顯異常的行為改變；HDM組、模型組小鼠激發(fā)前后出現(xiàn)甩頭、抓耳、撓鼻、煩躁多動等行為變化；祛風(fēng)宣肺湯組小鼠偶見有抓耳、甩頭、撓鼻的動作。

3.2 檢測BALF中IL－5、IL－13水平與空白組相比，冷刺激組和HDM組小鼠的BALF中IL－5、IL－13水平升高，模型組IL－5、IL－13的水平極顯著升高（P＜0.000 1），以模型組復(fù)制效果最佳。與模型組比較，祛風(fēng)宣肺湯組IL－5水平明顯降低（P＜0.05），IL－13水平有降低趨勢（P＞0.05）。見圖1。

圖1 支氣管肺泡灌洗液IL－5、IL－13細(xì)胞因子水平

3.3 檢測外周血EOS計數(shù)及IgE水平與空白組相比，冷刺激和HDM組小鼠的外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平升高，模型組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平顯著升高（P＜0.01），以模型組復(fù)制效果最佳。與模型組比較，祛風(fēng)宣肺湯組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平均顯著降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 血中嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及IgE水平

3.4 觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化空白組、冷刺激組肺組織可見肺泡紋理清晰，肺泡間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，氣道上皮完整，纖毛結(jié)構(gòu)清晰，肺組織形態(tài)基本正常；HDM組可見明顯肺泡間質(zhì)增寬，部分肺泡融合，氣道黏膜增厚，纖毛脫落，氣道周圍及肺泡間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡間質(zhì)及氣管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤增厚，部分肺泡融合，氣道上皮脫落；祛風(fēng)宣肺湯組的肺泡結(jié)構(gòu)完整，紋理清晰，間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜不厚，或見部分纖毛有脫落，病變程度明顯減輕。見圖3。

3.5 肺組織TRPM8蛋白表達(dá)情況與空白組相比，冷刺激組和HDM組小鼠肺組織TRPM8表達(dá)有升高的趨勢（P＞0.05），模型組小鼠肺組織TRPM8表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，祛風(fēng)宣肺湯組小鼠TRPM8通道蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖3 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×200）

圖4 小鼠肺組織TRPM8蛋白表達(dá)情況（×200）

圖5 免疫組化半定量分析結(jié)果

4 討論

支氣管哮喘是一種涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞組分的慢性呼吸道炎癥性疾病。一般認(rèn)為，特異性炎癥反應(yīng)是哮喘的重要病理機(jī)制。約50%哮喘患者表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子分泌增多、外周血EOS增加、血液IgE水平增高的病理特征［13］。EOS細(xì)胞型哮喘［14－15］、Th2細(xì)胞因子增高型哮喘［2，16］均屬于此類。IL－5和IL－13是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞因子。CD4＋T細(xì)胞分化失衡，Th1／Th2細(xì)胞因子比例失調(diào)可導(dǎo)致IL－5、IL－13水平升高［17］，誘發(fā)哮喘或加重哮喘的癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，除Th2細(xì)胞，2型固有淋巴細(xì)胞作為非T非B細(xì)胞亦是IL－5、IL－13的重要來源［18］，參與哮喘的特異性免疫的病理生理機(jī)制［17－18］。目前尚不可知兩者在哮喘發(fā)生發(fā)展中各自所占有的比重，比較公認(rèn)的是，氣道上皮的上游事件［主要調(diào)節(jié)因子如胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、IL－25、IL－33等與相應(yīng)受體結(jié)合］增加Th2型細(xì)胞因子的分泌，引起下游事件的級聯(lián)反應(yīng)，如特異性IgE水平升高，EOS、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞增殖、局部募集與激活，最終導(dǎo)致氣道重塑［2，17］。

TRPM8是瞬時受體電位離子通道蛋白（TRPs）的一員，是一種非選擇性鈣離子通道，可被低溫（8～22℃）刺激或薄荷醇激活。研究表明，TRPM8表達(dá)于氣道迷走神經(jīng)、氣道上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞胞膜表面［19－21］。冷刺激可通過激活TRPM8，刺激迷走神經(jīng)傳入纖維產(chǎn)生電沖動，引起由迷走神經(jīng)支配的氣道腺體黏液分泌增加、支氣管平滑肌收縮等一系列氣道反射活動，導(dǎo)致氣道阻力增加［20］。冷刺激還可通過氣道上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的TRPM8增加炎癥因子（如IL－1β、IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、IL－13、IL－25、IL－33、GM－CS、TNF－α）的分泌和組胺的釋放而加重哮喘［21－22］。其中IL－1β可促進(jìn)B細(xì)胞活化，激活Th2和Th17細(xì)胞參與哮喘和其他過敏性疾病的病理過程［23］。IL－6能促進(jìn)急性反應(yīng)蛋白的合成和IgE的轉(zhuǎn)化，并協(xié)調(diào)IL－1的表達(dá)，刺激T細(xì)胞的增殖和分化［24］；部分難治性哮喘患者痰標(biāo)本和BALF中可見IL－6和IL－8水平升高［25］。IL－25可促進(jìn)2型免疫反應(yīng)［26］；IL－25、IL－33能介導(dǎo)ILC2s分泌IL－4、IL－5、IL－13等Th2細(xì)胞因子，參與哮喘的病理機(jī)制。因此，TRPM8通路的開放可促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展，過表達(dá)TRPM8通道蛋白可增加炎癥因子的分泌［27］，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。相反，拮抗TRPM8通道蛋白可減少炎癥因子分泌，或可緩解哮喘的癥狀。

祛風(fēng)宣肺湯以苦溫麻黃宣肺平喘，辛溫紫蘇葉祛風(fēng)散邪，蟬蛻、全蝎止痙祛風(fēng)，半夏、佛耳草化痰理肺，白前、紫菀、百部降氣止咳，再佐以南沙參清肺養(yǎng)陰，以炙麻黃、半夏及紫蘇梗之燥，甘草為使，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏祛風(fēng)解痙、理肺止咳之功效，臨床上用于反復(fù)咳嗽、干咳少痰的咳嗽變異性哮喘頗有療效。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用冷刺激或HDM干預(yù)均可刺激機(jī)體分泌IL－5、IL－13，導(dǎo)致EOS增殖，抗體表達(dá)增多，肺泡表面及氣道上皮的TRPM8通道蛋白表達(dá)增加，聯(lián)合冷刺激和HDM建?？娠@著放大此生物學(xué)效應(yīng)，從病理機(jī)制上模擬了因氣溫變化而急性發(fā)作的哮喘模型，使用祛風(fēng)宣肺湯后，小鼠的炎癥指標(biāo)明顯降低，病理改變顯著減輕，這初步解釋了哮喘患者門診量、住院率在換季時增加的現(xiàn)象及祛風(fēng)宣肺湯的作用機(jī)理。結(jié)合文獻(xiàn)研究和實驗結(jié)果推測，祛風(fēng)宣肺湯可通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生、下調(diào)TRPM8通道蛋白表達(dá)而緩解過敏性哮喘。而本實驗缺少小鼠的肺功能等相應(yīng)指標(biāo)，缺少設(shè)立TRP通道拮抗劑作為對照組，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。