隗陳征,劉鷹,任紀(jì)龍,馬洪婧,吳英海,韓蕊*

(1.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

將鐵基填料引入BAF中形成鐵-氮循環(huán)進(jìn)而促進(jìn)氮轉(zhuǎn)化被認(rèn)為可以有效提高系統(tǒng)脫氮效率[8]。鐵循環(huán)和氮循環(huán)因互為電子供體和受體，可以通過生物作用和非生物作用耦合。海綿鐵填料引入水處理系統(tǒng)可通過吸附固定好氧、兼性厭氧和厭氧等細(xì)菌形成生物海綿鐵，并利用其特殊的化學(xué)性能增強(qiáng)系統(tǒng)脫氮性能。李杰等[9]通過將傳統(tǒng)活性污泥法中的填料替換為海綿鐵形成了生物海綿鐵體系，提高了系統(tǒng)的脫氮除磷能力。匡穎等[10]在海綿鐵與火山巖填料A/O生物滴濾池脫氮除磷試驗(yàn)中研究證明，海綿體的引入提高了滴濾池的脫氮除磷能力。目前，已有對(duì)鐵-氮耦合的微生物機(jī)理研究，但其中多為針對(duì)自然環(huán)境和生活污水的處理研究[11-14]，而針對(duì)循環(huán)海水養(yǎng)殖廢水處理的研究較少。因此，通過對(duì)BAF中填料生物膜細(xì)菌群落進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，并對(duì)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，揭示反應(yīng)器細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)從而解析系統(tǒng)脫氮內(nèi)在機(jī)理[15-16]，并定向調(diào)控脫氮功能細(xì)菌群落，對(duì)于降低養(yǎng)殖水體中氮素積累具有非常重要的意義。

本研究中，以生物海綿鐵與PPC凝膠親水填料形成復(fù)合填料，設(shè)置了不同曝氣運(yùn)行方式，并通過16S rDNA高通量測(cè)序，研究了不同曝氣方式下不同填料上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、豐度和多樣性等，探究了不同曝氣運(yùn)行方式下系統(tǒng)脫氮性能及細(xì)菌群落變化，以期通過優(yōu)化曝氣運(yùn)行方式解析脫氮相關(guān)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高BAF系統(tǒng)的脫氮性能。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)裝置如圖1所示，試驗(yàn)用BAF為圓柱形(直徑10 cm、高60 cm)，有機(jī)玻璃材質(zhì)，在BAF底部安裝有布水板以支撐填料和均勻布水。采用海綿鐵(購(gòu)自河南希堯環(huán)保科技有限公司，粒徑0.5～5.0 mm，含鐵量大于95%)與PPC凝膠填料作為復(fù)合填料，海綿鐵與PPC凝膠填料配比為1∶3(質(zhì)量比)，并使兩種填料混合均勻，用網(wǎng)兜固定，每個(gè)反應(yīng)柱內(nèi)填料總質(zhì)量為900 g。通過時(shí)間控制器(AL-06，小耳朵電子科技有限公司)控制間歇曝氣時(shí)長(zhǎng)，其中，柱A連續(xù)曝氣24 h，柱B曝氣12 h，間歇12 h，柱C曝氣0 h，系統(tǒng)進(jìn)水為上流式，通過高位水箱進(jìn)入系統(tǒng)。系統(tǒng)運(yùn)行溫度通過加熱棒控制在(30.0±0.5)℃，水力負(fù)荷率(HLR)通過蠕動(dòng)泵調(diào)控在1.2 m3/(m2·d)，碳氮比(C/N)為3∶1，pH為7.0±0.5。

A—24 h連續(xù)曝氣； B—12 h間歇曝氣； C—0 h曝氣； 1—海綿鐵與PPC復(fù)合填料； 2—溢流口； 3—高位水箱； 4—蓄水池； 5—蠕動(dòng)泵； 6—?dú)馐?7—取樣口。

1.2 方法

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及取樣 待系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后，從反應(yīng)器最上方取樣口進(jìn)行取樣。每次用50 mL的無菌離心管收集水樣50 mL。待系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行20 d后，在無菌條件下，分別將3個(gè)生物濾器中復(fù)合填料的海綿鐵和PPC凝膠填料手動(dòng)分離，分別用無菌離心管收集，編號(hào)A1、A2、A3分別為曝氣24、12、0 h的海綿鐵填料，B1、B2、B3分別為曝氣24、12、0 h 的PPC凝膠親水填料，每個(gè)填料組設(shè)3個(gè)重復(fù)，取各組填料樣品置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定。

η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%。

1.2.4 DNA提取和16S rDNA高通量測(cè)序 采用十六烷基三甲基溴化銨法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，采用16S V4區(qū)引物(515F 和806R)，使用帶Barcode的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。高通量測(cè)序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，構(gòu)建PCR-free文庫(kù)，然后進(jìn)行雙末端測(cè)序。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，通過對(duì)Reads拼接，平均每個(gè)樣品測(cè)得93 314條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到87 852條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)64 631，質(zhì)控有效率達(dá)70%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，進(jìn)行聚類時(shí)，先將序列按照豐度從大到小排序，通過97%相似度的標(biāo)準(zhǔn)聚類，得到16S rDNA OTU，每個(gè)OTU被認(rèn)為可代表一個(gè)細(xì)菌物種(微生物物種)[18]。試驗(yàn)中共得到5 353個(gè)OTUs，然后對(duì)OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，注釋結(jié)果中，共有2 009(38%)個(gè)OTUs注釋到屬水平。通過對(duì)不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha diversity 分析指數(shù)(Shannon、Chao1、ACE和good_coverage)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。通過多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(unweighted unifrac)對(duì)距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析PCoA(principal co-ordinates analysis)。基于unweighted unifrac 距離繪制熱圖用來評(píng)估微生物樣品組間的物種差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同曝氣處理下的水質(zhì)測(cè)定

圖2 不同曝氣處理下的去除率

圖3 不同曝氣處理下的質(zhì)量濃度

2.2 16S rRNA高通量測(cè)序

2.2.1 細(xì)菌群落組成 從圖4可見：各處理組均是變形菌門Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)含量約占總細(xì)菌組成的52.1%～80.1%，其次是厚壁菌門Fermicutes、擬桿菌門Bacteroidetes，分別占23.3%～0.9%、11.4%～0.1%，其他相對(duì)豐度較少的細(xì)菌屬為放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、硝化螺旋菌門Nitrospirae、浮霉菌門Planctomycetes等；A2組微生物組成與其他組差異較大，其變形菌門相對(duì)豐度最少，為52.1%，而厚壁菌門和變形桿菌門相對(duì)豐度最多，分別為23.3%和11.4%，芽孢桿菌綱Bacilli(10.3%)和梭菌綱Clostridia(11.4%)相對(duì)豐度均高于其他處理組；而與A2組在同一個(gè)反應(yīng)器的B2組，變形菌門(80.1%)與γ-變形菌綱γ-Proteobacteria相對(duì)豐度均最多。

圖4 各處理組門水平和綱水平微生物組成

從圖5可見：在屬水平上，不同曝氣方式的細(xì)菌群落組成差異較大；A1組中亞硝化螺菌屬Nitrosospira相對(duì)豐度較大(6.6%)，A2組中的不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter(1.7%)、擬桿菌屬Bacteroides(6.9%)、代爾夫特菌屬Delftia(1.9%)和兼性厭氧的葡萄球菌屬Staphylococcus(5.3%)相對(duì)豐度均高于其他處理組，B2組中發(fā)光桿菌屬Photobacterium為優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度62%)；弧菌屬Vibrio在B3和B1組中大量存在(相對(duì)豐度分別為11.7%和10.5%)，而在A2和B2組中含量較低(分別為2.8%和4.8%)。

圖5 各處理組屬水平微生物組成

2.2.2 微生物豐度和多樣性結(jié)果 Alpha多樣性分析結(jié)果如表1所示，其中覆蓋率均在0.99以上，說明樣品文庫(kù)覆蓋率高，數(shù)據(jù)可靠，而A2組平均Shannon、Chao1和ACE指數(shù)均最大，平均值分別為7.44、2 396和2 484。

表1 0、12、24 h曝氣處理微生物的Alpha多樣性指數(shù)

從圖6(a)可見，第一、第二主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)率分別為16.78%、12.37%，對(duì)于各樣本微生物群落構(gòu)成的累計(jì)貢獻(xiàn)率為29.15%，A1組與B1組，A2組與B2組，A3組與B3組間存在較大差異。從圖6(b)可見：對(duì)于BAF的海綿鐵處理而言，A2組與A3組差異最大，相異系數(shù)為0.360，其次是A2組與A1組，相異系數(shù)為0.274；對(duì)于PPC填料處理，B1組與B3組差異最大，相異系數(shù)為0.145。

圖6 各處理組的Beta多樣性PCoA圖和矩陣距離熱圖

所有處理組共同擁有OTUs為1 106，占OTUs總數(shù)的49.1%，A2組特有OTUs數(shù)量為345，高于其他處理組(圖7(a))；海綿鐵填料處理組共同擁有OTUs為1 558，A2組特有OTUs數(shù)量最高為888，遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)處理組(圖7(b))；PPC填料共同擁有OTUs為1 487，B1處理組特有OTUs數(shù)量最高，為560(圖7(c))；海綿鐵填料處理組共同擁有OTUs數(shù)高于PPC填料處理。

圖7 總體韋恩圖、海綿鐵填料韋恩圖和PPC填料韋恩圖

3 討論

3.1 系統(tǒng)脫氮性能分析

3.2 曝氣生物濾器細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究表明，在門和綱水平上，不同間歇運(yùn)行方式下海綿鐵填料和PPC填料細(xì)菌群落組成均存在差異，這說明不同的曝氣運(yùn)行方式和填料類型均影響系統(tǒng)細(xì)菌群落組成，從而導(dǎo)致各處理組脫氮效果的差異。在不同填料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面，海綿鐵填料處理組的厚壁菌門及芽孢桿菌綱相對(duì)豐度均高于PPC填料處理組，這說明海綿鐵填料結(jié)構(gòu)更適宜好氧或兼性厭氧的厚壁菌門細(xì)菌生長(zhǎng)。PPC填料處理組浮霉菌門和變形菌門相對(duì)豐度均高于海綿鐵填料處理組。目前，已知的厭氧氨氧化菌都屬于浮霉菌門，說明PPC填料表面更易富集厭氧氨氧化菌，對(duì)系統(tǒng)中氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)獠南到y(tǒng)中脫出起到關(guān)鍵作用[21]。本研究中，生物海綿鐵填料處理組的γ-變形菌綱含量均低于PPC填料處理組，以往研究也表明，大量好氧和兼性厭氧細(xì)菌屬于γ-變形菌綱，均為既能進(jìn)行呼吸代謝又能進(jìn)行發(fā)酵代謝的兼性異氧菌[3,22]，這說明鐵基填料會(huì)抑制γ-變形菌綱菌屬的富集。因此，海綿鐵和PPC填料形成的復(fù)合填料能夠富集廣譜脫氮相關(guān)的細(xì)菌群落，從而提高系統(tǒng)脫氮性能。

本研究表明，在屬水平上，不同間歇運(yùn)行方式的細(xì)菌群落組成差異較大，其中，A2和B2組細(xì)菌屬水平組成與其他組存在較大差異(圖5)。A2組中大量存在的擬桿菌屬為污水處理中活性污泥的常見優(yōu)勢(shì)屬，田道賀等[27]在研究硝化型生物絮團(tuán)的馴化培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過馴化擬桿菌屬成為硝化型生物絮團(tuán)的優(yōu)勢(shì)菌屬，其與硝化作用密切相關(guān)，進(jìn)一步證明12 h間歇曝氣處理具有較強(qiáng)的硝化作用。A2組中相對(duì)豐度較多的不動(dòng)桿菌屬[28]和代爾夫特菌屬也包含了部分好氧反硝化菌，其中，代爾夫特菌屬中的部分菌種具有良好的好氧反硝化能力[29]。兼性厭氧的葡萄球菌屬在A2組中相對(duì)豐度也較高，該屬中部分菌種屬于反硝化聚磷菌，通常具有良好的反硝化性能[30-31]。在B2組中發(fā)光桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度為62%)，研究表明，該菌屬菌株能生長(zhǎng)在含海水、D-葡萄糖和NH4Cl的無機(jī)培養(yǎng)基中，是一種兼性厭氧的化能異養(yǎng)菌，該屬部分菌株屬于好氧反硝化菌[32]。

綜上所述，12 h間歇曝氣運(yùn)行條件使得系統(tǒng)能夠富集兼性厭氧及好氧脫氮功能菌，這是12 h間歇曝氣處理具有良好脫氮能力的原因之一。

3.3 組間共有及特有OTU分析

本研究表明，A2組OTUs數(shù)目最高，說明A2組的微生物多樣性高于其他組，這說明在間歇曝氣條件下營(yíng)造出有氧-缺氧甚至厭氧的環(huán)境條件，適宜富集更廣氧氣耐受范圍的微生物群落。生物海綿鐵填料微生物多樣性高于PPC填料(圖7(a))，因?yàn)楹＞d鐵本身具有一定的除氧作用，可在系統(tǒng)中為各種好氧、兼氧和厭氧微生物的協(xié)同共生提供良好的“微環(huán)境”，在整個(gè)復(fù)合填料中，生物海綿鐵填料上的微生物是導(dǎo)致3個(gè)試驗(yàn)組脫氮效果差異的主要微生物因素。A2組特有OTUs遠(yuǎn)高于其他處理，進(jìn)一步說明該處理組微生物多樣性最高，說明12 h間歇曝氣對(duì)海綿鐵填料上的微生物多樣性有利。在PPC填料處理中，B1組OTUs高于B2、B3組，這說明曝氣24 h處理在PPC填料上的微生物多樣性高于其他兩種曝氣運(yùn)行方式，推測(cè)是由于PPC填料雖然與海綿鐵填料混合，但仍不會(huì)達(dá)到完全混合均勻的狀態(tài)，故在PPC填料內(nèi)部的鐵離子遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于海綿鐵填料上的鐵離子，所以PPC填料上的鐵氧化菌和鐵還原菌的數(shù)量小于海綿鐵填料，此時(shí)24 h連續(xù)曝氣對(duì)硝化作用的加強(qiáng)效果要比鐵-氮循環(huán)對(duì)微生物多樣性的促進(jìn)效果強(qiáng)，導(dǎo)致B1組的生物多樣性高于B2組[33]。

3.4 微生物豐度和多樣性分析

3.4.1 Alpha多樣性分析 群落生態(tài)學(xué)中，通過樣品的多樣性分析(Alpha 多樣性)，可以反映微生物群落的豐度和多樣性[34]。根據(jù)測(cè)序公司提供的報(bào)告，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高[7,24]。本研究中，A2組Shannon指數(shù)最高，這說明A2組的群落多樣性最高，與群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映微生物群落豐度，Chao1和ACE指數(shù)數(shù)值越大，表明樣本物種豐度越大。本研究中，A2組Chao1和ACE指數(shù)均最大(表1)。其原因可能是由于12 h曝氣處理通過間歇曝氣的方法在不同時(shí)段分別強(qiáng)化了硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)，研究表明，與鐵-氮循環(huán)相關(guān)的鐵氧化菌和鐵還原菌的生長(zhǎng)多伴隨著反硝化反應(yīng)[35]，所以A2組的環(huán)境適合鐵氧化菌和鐵還原菌的生長(zhǎng)，故12 h曝氣處理組中的細(xì)菌群落豐度和多樣性要高于24 h曝氣處理組。

4 結(jié)論

2)通過12 h間歇曝氣處理可改變生物濾器的內(nèi)部環(huán)境，形成良好的好氧-缺氧交替環(huán)境，明顯提高了填料微生物多樣性，其中，海綿鐵填料上具備反硝化能力的不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter和代爾夫特菌屬Delftia，以及PPC填料上的發(fā)光桿菌屬Photobacterium相對(duì)豐度均有所提高，這些菌屬通過強(qiáng)化反硝化過程提升了系統(tǒng)整體脫氮性能。

3)由于鐵基填料的引入，在間歇曝氣條件下促進(jìn)了鐵-氮耦合過程，使海綿鐵和PPC凝膠復(fù)合填料上富集了更多的反硝化菌，這是12 h間歇曝氣處理脫氮性能提升的原因之一。但是關(guān)于系統(tǒng)中鐵氧化還原調(diào)控氮轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。