周欣，高風(fēng)英，盧邁新*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

近年來，魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展穩(wěn)定，2019年中國水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到5 079.07萬t，魚類占到2 708.61萬t，其中，海水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量160.58萬t，淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量2 548.03萬t，養(yǎng)殖面積達(dá)711萬hm2[1]。根據(jù)2018年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織發(fā)布的報告，隨著經(jīng)濟的增長，人們對優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的選擇趨勢也增加，魚產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)和必需微量營養(yǎng)素的重要來源之一，其發(fā)展的健康和穩(wěn)定十分重要[2]，并且魚類產(chǎn)品消費的益處遠(yuǎn)大于危害[3]。然而，魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)活動易受到多種因素的影響，且魚類生存對水質(zhì)、水溫等生存環(huán)境存在著嚴(yán)格的要求，近年來，為了滿足水產(chǎn)品日益增長的需求，多數(shù)地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式從粗放型轉(zhuǎn)變?yōu)榧s型，因此，極易導(dǎo)致養(yǎng)殖動物疾病的暴發(fā)[4]，且不同的魚類物種所面臨的病害問題也不同，主要是細(xì)菌性和病毒性疾病。如由鰻弧菌Vibrioanguillarum引起的牙鲆Paralichthysolivaceus弧菌病[5]，這對分布在中國、日本和韓國海域的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[6-7]。半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis是分布在中國沿海地區(qū)具有極高經(jīng)濟價值的名貴魚類，其生長快、肉質(zhì)鮮美，但近年來隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，細(xì)菌病害威脅越來越嚴(yán)重，其中，哈維氏弧菌Vibrioharveyi是侵入半滑舌鰨的主要細(xì)菌性病原之一，能夠引起爛鰭等疾病[8-9]。此外，哈維氏弧菌也可誘發(fā)大黃魚Larimichthyscrocea弧菌病[10]，更為嚴(yán)重的是若誤食感染哈維氏弧菌的食物或水，會引發(fā)人腹瀉或敗血癥、中耳炎等疾病[11]。羅非魚Oreochromisspp.是聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織推薦的21世紀(jì)重要淡水養(yǎng)殖品種之一，是全球未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一[12]，但羅非魚集約化養(yǎng)殖模式的大規(guī)模推廣及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，使得病害暴發(fā)越來越嚴(yán)重，特別是無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae感染的傳播速度和引起的死亡率逐漸增加。2009年以來，在以色列、厄瓜多爾、埃及、泰國和印度等多個國家和地區(qū)的羅非魚中暴發(fā)了一種由羅非魚湖病毒(Tilapia Lake virus, TiLV)引起的病毒性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織列為一種新生病毒，對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅[13-14]。除此之外，鯽皰疹病毒(Carassiusauratusherpesvirus, CaHV)和草魚Ctenopharyngodonidellus呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)等其他多種魚類病害也頻頻暴發(fā)。因此，為保障魚類養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展，培育抗病力強的優(yōu)良品種就顯得十分重要。

1 魚類抗病育種的起源

從病理學(xué)研究上來看，人們已經(jīng)掌握了多種治療或預(yù)防魚類疾病的方法，如使用抗生素、化療藥物及接種疫苗等。但過度使用抗生素不僅會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，抗生素進入到人體中也會對人造成傷害[11]；化療藥物的使用易造成環(huán)境污染及副作用發(fā)生；而疫苗接種及益生菌和免疫刺激劑的使用等相關(guān)方法在養(yǎng)殖實踐中難以大規(guī)模實施[15]。因此，國內(nèi)外專家開始研究魚類固有的抗病遺傳因素，并進行選擇育種從而建立抗病品系[16]。與其他物種相比，魚類的選擇育種研究起源較晚。

國外第一次有文獻記載的魚類選擇育種是1920年在美洲紅點鮭Salvelinusfontinalis中進行的抗病新品系培育[17]。國內(nèi)科學(xué)系統(tǒng)的魚類選擇育種起源較晚，20世紀(jì)70年代出現(xiàn)相關(guān)研究[18]。抗病育種相關(guān)研究起源于吳維新等[19]將鯉和草魚雜交一代與草魚回交獲得三倍體草魚型雜種，并經(jīng)多年從雜交一代異緣四倍體中選育出可育的二倍體83-2系抗病草魚[20]。

近年來，隨著魚類遺傳學(xué)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，以及對魚類基因組的探索，研究人員建立了一系列的育種技術(shù)，包括家系與群體選育、分子標(biāo)記輔助選育和全基因組選育等。

2 國內(nèi)魚類家系及群體選育研究

家系選育是應(yīng)用較為廣泛的育種方式，也為分子育種奠定了基礎(chǔ)。其原理是通過逐代提高目的基因的純合度，建立優(yōu)良性狀家系，獲得具有優(yōu)良性狀且穩(wěn)定的新品種，實際上就是對基因型的選擇。近年來，國內(nèi)外研究人員采用此方法在多種魚類的抗病育種工作中取得了重要進展，如牙鲆、虹鱒Oncorhynchusmykiss和草魚等。通過加性遺傳方差分析證明，對虹鱒病毒性出血性敗血病抗病力進行選育的方法是可行的[21]。通過自然選擇和人工感染遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda，對63個牙鲆家系的生長和抗病性能進行初步測定，從中鑒定得到3個抗病力強的家系[22]；進一步以抗病牙鲆品種為親本建立了57個家系，選擇其中46個家系進行感染試驗，從中鑒定出5個抗病家系[23]；從28個優(yōu)質(zhì)抗病牙鲆家系中篩選得到7個高抗病力(攻毒感染存活率>66%)的家系[24]；在建立的抗淋巴囊腫(Lymphocystis disease，LD)牙鲆品系中，通過在淋巴囊腫病高發(fā)養(yǎng)殖場進行天然攻毒試驗，得到G2家系，以此為基礎(chǔ)繼續(xù)選育，有望得到抗LD牙鲆新品種[25]。另外，遺傳評定模型分析表明，采用家系選育的方式適合對半滑舌鰨抗哈維氏弧菌性狀進行選育[26]。在野生草魚中已被證實抗GCRV能力較好的個體遺傳力較高，為構(gòu)建草魚選擇育種提供了基礎(chǔ)[27]。

除此之外，采用上述類似的方法在其他魚類選擇育種中也取得了一定進展。許氏平鲉Sebastesschlegelii的遺傳改良和優(yōu)質(zhì)新品系選育就是通過群體選育和家系選育相結(jié)合的方法進行的[28]。羅非魚不同家系的抗鏈球菌能力存在顯著性差異[29]；通過對42個吉富羅非魚Oreochromisniloticus家系人工腹腔注射感染無乳鏈球菌，評估篩選出抗病力強且生長速度快的7個家系[30]；吉富羅非魚經(jīng)過2個世代的選育，抗病能力便得到了較大提高[31]。羅非魚不同品種間的抗病力也不同[32-35]，這為新品種的選育提供了基礎(chǔ)和材料。此外，鏡鯉Cyprinuscarpiovar.specularis抗錦鯉皰疹病家系選育已經(jīng)進行到了F3代[36]。

以上研究結(jié)果均表明，家系選育是培育魚類抗病優(yōu)良品種的有效途徑，且已在多種魚類選育中取得成功，證明其是培育抗病新品系的重要手段。

3 魚類抗病選育的分子標(biāo)記輔助研究

常規(guī)的魚類育種選育策略是利用細(xì)菌或病毒對種群內(nèi)的個體感染以篩選出抗病能力較強的個體留種選育。但因魚類的抗病力不僅受遺傳影響，而且受環(huán)境影響，表型變異不能完全或真實地反映遺傳變異[37]，所以這種方法可信度不高，并且選育周期長。隨著遺傳學(xué)研究的發(fā)展，尤其是“數(shù)量遺傳學(xué)理論”的提出，動物育種技術(shù)進入到快速發(fā)展時期。數(shù)量遺傳學(xué)理論的觀點是生物的若干性狀(如抗病)是由許多微小的基因共同決定的，這些微小基因被稱為數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)。但若僅研究控制某一性狀的多個微小基因，無法準(zhǔn)確定位到每一個微小基因并準(zhǔn)確估計其單個基因的效應(yīng)[38]。分子標(biāo)記技術(shù)是傳統(tǒng)育種選育技術(shù)的輔助手段，即保留了家系選育的優(yōu)點，也能夠?qū)τ谀承┬誀畹腝TL位點進行精確定位，篩選和培育優(yōu)良品種。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記進行區(qū)域或全基因組篩選，從而減少連鎖冗余，達(dá)到提高育種效率的目的。目前，在魚類抗病育種中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)主要有微衛(wèi)星標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(SNP)技術(shù)兩種。

3.1 魚類抗病相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及QTL定位

微衛(wèi)星標(biāo)記是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列，由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性且數(shù)量豐富，故該技術(shù)應(yīng)用廣泛。采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對不同家系間的遺傳結(jié)構(gòu)和差異進行分析，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜并對抗病基因進行精準(zhǔn)的QTL定位，可為后續(xù)的抗病選育奠定基礎(chǔ)。

在中國，由微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建的魚類高密度遺傳連鎖圖譜首先在鯉Cyprinuscarpio[39]、半滑舌鰨[40]、牙鲆[41]、鰱Hypophthalmichthysmolitrix[42]和鳙Aristichthysnobilis[43]等幾種重要經(jīng)濟魚類中完成(表1)。目前，將與 LD 抗性相關(guān)的遺傳連鎖圖譜連鎖群LG15上的主要基因座LD-R作為標(biāo)記輔助育種的候選微衛(wèi)星基因座，成功獲得牙鲆Paralichthysolivaceus抗病品系[6, 44]。采用基因分型微衛(wèi)星識別方法已成功對大西洋鮭Salmosalar抗傳染性鮭魚貧血癥進行QTL定位[45]。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已成功對4種大菱鲆Scophthalmusmaximus品系的殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida抗性進行QTL定位[46]。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在吉富品系尼羅羅非魚中篩選出2個與抗病性狀相關(guān)的位點[47]。采用混合分離子分析法(bulked segregant analysis，BSA)對半滑舌鰨中169個微衛(wèi)星標(biāo)記進行篩選，在感染試驗存活率為52.22%的家系中得到了1個可能與抗哈維氏弧菌相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，并成功對其進行了QTL定位，這為選育抗病新品種提供了基礎(chǔ)和依據(jù)[9]。目前，在多種魚類中完成了對抗病基因的精準(zhǔn)QTL定位(表2)。

表1 部分魚類微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜構(gòu)建情況

表2 部分魚類抗病相關(guān)QTL定位

3.2 基于候選基因的魚類抗病相關(guān)SNP標(biāo)記篩選

SNP是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，能夠建立起更加密集的SNP圖譜，遺傳穩(wěn)定性高、位點豐富且分布廣泛、易于基因分型，從而定位出與目的性狀更加緊密相關(guān)的標(biāo)記或QTL區(qū)間[66]。近年來，SNP標(biāo)記篩選技術(shù)在魚類育種中得到廣泛應(yīng)用(表3)。

表3 部分魚類抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選研究進展

評估SNP位點的多態(tài)性并采用Snapshot法進行分型驗證，在鯉的11個基因中檢測到20個可用于連鎖分析的標(biāo)記[67]。草魚作為中國主要的淡水養(yǎng)殖魚類，病害頻發(fā)嚴(yán)重,缺乏良種，但草魚的優(yōu)良性狀選育已經(jīng)取得了重要的進展。目前，利用測序篩查SNP位點，并采用Snapshot進行分型驗證的方法，在草魚抗呼腸孤病毒基因Mx2、TLR3(Toll樣受體基因3)、補體C6、RIG-Ⅰ(視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ)、LGP2(RIG-Ⅰ樣受體家族成員遺傳生理學(xué)實驗室2,laboratory of genetics and physiology 2)、MAD5(黑色素瘤分化相關(guān)基因5， melanoma differentiation-associated gene 5)和IPS-Ⅰ(β-干擾素啟動子刺激因子Ⅰ， interferon-b promoter stimulator Ⅰ)中發(fā)現(xiàn)多個對草魚GCRV抗性或易感性性狀顯著相關(guān)的SNP位點及單倍型。這些SNP位點和單倍型可以作為潛在的分子標(biāo)記輔助篩選草魚抗出血病品系[68-75]。通過人工感染篩選出異育銀鯽Carassiusauratusgibelio易感克隆系和抗性克隆系，進一步鑒定出8個干擾素(interferon, IFN)相關(guān)基因與抗CaHV的侵染有關(guān)，可為今后異育銀鯽抗病育種提供科學(xué)依據(jù)[76-77]。利用測序篩查SNP位點并采用Snapshot進行分型驗證的方法，在羅非魚IPS-Ⅰ、NOD1(核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域1,nucleotide binding and oligomerization domain 1)、β2m(β2-微球蛋白，β2-microglobulin)、IKaros(C2H2型鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子)、LBP(脂多糖結(jié)合蛋白， lipopolysaccharide binding protein)和MCP-8(肥大細(xì)胞蛋白酶-8, mast cell protease-8)基因中篩選到與無乳鏈球菌抗性/易感相關(guān)單倍型或SNP位點[78-83]。這些SNP位點和單倍型可以作為潛在的分子標(biāo)記輔助篩選羅非魚抗鏈球菌病品系。

4 候選基因MHC多態(tài)性與抗病性的相關(guān)性

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是編碼動物主要組織相容性抗原基因群的統(tǒng)稱，分為MHCⅠ類和Ⅱ類分子，由其所編碼的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白可以結(jié)合內(nèi)外源抗原并呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。多基因性、高度多態(tài)性是與抗病力相關(guān)的MHC類基因的兩個重要特性，目前公認(rèn)其是研究與抗病/敏感表型相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性分子標(biāo)記最合適的候選基因。Miretti等[87]2005年發(fā)表了涵蓋人MHC基因區(qū)域4.46-Mb高分辨率(1.9 kb)的連鎖不平衡圖譜及第一代標(biāo)簽SNP，這使得基因分型效率增加了5倍，從而可用于未來與MHC相關(guān)的所有疾病研究中。由于魚類MHC的高度多態(tài)性，其在抗病選育中備受關(guān)注，如在大西洋鮭、虹鱒和鏡鯉等魚類中發(fā)現(xiàn)，MHC位點具有高度多態(tài)性且與抗病力有關(guān)[88-89]。

4.1 魚類MHCⅠ 類基因

1990年，研究者第一次擴增出魚類的MHCⅠA鏈基因[90]，1993年，在大西洋鮭中測得第一條魚類MHCⅠA鏈 cDNA全序列[91]，隨后陸續(xù)報道了多種魚類的MHCⅠ類基因cDNA序列。不同的硬骨魚類中MHC基因的拷貝數(shù)不同，但其結(jié)構(gòu)與哺乳動物相似。

4.2 魚類MHC Ⅱ類基因

1993年，第一條魚類MHCⅡA基因cDNA序列首次在斑馬魚中被報道[92]。根據(jù)目前所得到的魚類MHCⅡAcDNA分子序列，推測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與哺乳動物相似。MHCⅡB基因是MHC基因中被研究最多的，其具有豐富的多態(tài)性，如牙鲆MHCⅡB基因的多態(tài)性[93]。

4.3 MHC 基因多態(tài)性與魚體抗病性的關(guān)系

1999年，Van Muiswinkel等[94]提出MHC與魚類疾病抗性具有重要關(guān)系。之后，國內(nèi)外對多種魚體抗病性與MHC多態(tài)性的關(guān)系進行了研究(表4)。如急性病毒感染過程中，虹鱒MHCⅠ基因在病毒感染期間表達(dá)顯著下調(diào)[89]。大西洋鮭MHCⅠ和MHCⅡ類基因的多態(tài)性也與抗貧血病毒和癤病有關(guān)[95]。

表4 MHC基因多態(tài)性與魚體疾病抗性的關(guān)系

4.3.1MHCⅡA基因多態(tài)性與抗病性 荷包紅鯉CyprinuscarpioLinnaeusMHCⅡA類基因具有較高的多態(tài)性，等位基因Cyca-DXA4和Cyca-DXA5與對嗜水鏈球菌的敏感性顯著相關(guān)，而Cyca-DXA17、Cyca-DXA18和Cyca-DXA19與其對嗜水鏈球菌病抗性相關(guān)[96]。團頭魴MHCⅡA基因的多態(tài)性與抗細(xì)菌性敗血癥性狀也具有顯著關(guān)聯(lián)[84]。在牙鲆60個家系的MHCⅡA和MHCⅡB基因中，篩選到與弧菌病抗性密切相關(guān)的抗病/敏感家系MHC等位基因，其可作為分子標(biāo)記進行抗弧菌病牙鲆品系的選育[97-98]。通過新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)侵染試驗研究了MHCⅡA基因多態(tài)性與斜帶石斑魚Epinepheluscoioides抗病/敏感性的關(guān)系，結(jié)果得到了37個高多態(tài)性等位基因，經(jīng)過驗證分析發(fā)現(xiàn)，與SGIV敏感性和SGIV抗性相關(guān)的等位基因各一個[99]。在黃河鯉中發(fā)現(xiàn)多個維氏氣單胞菌Aeromonasveronii易感性相關(guān)的等位基因，經(jīng)驗證MHCⅡ類基因在黃河鯉抵抗病原入侵的過程中有著不可或缺的重要作用[100]。大西洋鮭MHCⅡ基因多態(tài)性與對鮭瘡痂魚虱Lepeophtheirussalmonis的敏感性間具有相關(guān)性[101]。在虹鱒中采用聚合酶鏈反應(yīng)-SSCP分析技術(shù)等方法檢測MHCⅡA類DAA基因(尤其是外顯子2)的多態(tài)性，并研究其與對傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)抵抗力的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與抗性有關(guān)的兩個等位基因Onmy-DAA*1301和Onmy-DAA*0304[102]。從鮸魚Miichthysmiiuy中發(fā)現(xiàn)共有48個(Mimi-DAB)功能基因，并預(yù)測有14個MHCⅡB類位點與抗原結(jié)合位點相關(guān)；還鑒定出40個MHCⅡA類(Mimi-DAA)功能基因，預(yù)測有5個位點與肽抗原的結(jié)合有關(guān)[103-104]。尼羅羅非魚個體中MHCⅡA類基因多態(tài)性與無乳鏈球菌感染的易感程度間的關(guān)聯(lián)分析表明，等位基因orni-daa*1101與無乳鏈球菌的易感性有關(guān)；而MHCⅡA等位基因第2外顯子可用于探索疾病易感性或抗性與MHCⅡA的多樣性間的聯(lián)系[105]。Wynne等[106]利用MHCⅡ類基因作為分子標(biāo)記成功地篩選出了抗阿米巴鰓病(Amoebic gill disease, AGD)的大西洋鮭品系。

4.3.2MHCⅡB基因多態(tài)性與抗病性 在關(guān)于MHCⅡB基因的研究中，研究人員通過分析抗病和不抗病牙鲆的MHCⅡB基因多態(tài)性，篩選得到與抗病相關(guān)聯(lián)的MHCⅡB等位基因[93]。采用RACE法成功克隆出赤點石斑魚EpinephelusakaaraMHCⅡB基因的cDNA全序列，并利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析技術(shù)證明了赤點石斑魚MHCⅡB的表達(dá)多態(tài)性[107]。對斜帶石斑魚MHCⅡB基因多態(tài)性也進行了研究，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果證明，等位基因EPCO-DBB*1001與SGIV抗性顯著相關(guān)[108]。在對半滑舌鰨MHCⅡB基因多態(tài)性與抗病相關(guān)性的研究中，得到9個與鰻弧菌病抗性/敏感性相關(guān)的位點[109]。在虹鱒中鑒定出45個不同的MHCⅡB類等位基因，其中Onmy-DAB*0201、Onmy-DAB*0904和Onmy-DAB*1102與IHNV易感性相關(guān)[110]。在大菱鲆抗病性與MHCⅡB基因多態(tài)性的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),與抗病/敏感相關(guān)的MHCⅡB基因型各1個[111]。在“全紅”體色甌江彩鯉Cyprinuscarpiovar.color中也發(fā)現(xiàn)了與抗病/易感病群體相關(guān)的MHCⅡB基因型[112]。卵形鯧鯵TrachinotusovatusMHCⅡB 基因第2外顯子多態(tài)性與美人魚發(fā)光桿菌Photobacteriumdamsela抗性/敏感性有關(guān)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，1個等位基因與其抗性有關(guān)，3個等位基因與其敏感性有關(guān)[113]。根據(jù)尼羅羅非魚F1代基因型和F3代鏈球菌抗性/易感性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0107、Orni-DAB*0201和Orni-DAB*0302與鏈球菌抗性顯著相關(guān), 等位基因Orni-DAB*0701與鏈球菌易感顯著相關(guān)[114]。在該研究之前，對尼羅羅非魚的研究也表明，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0201與鏈球菌抗性顯著相關(guān)[115]。因此，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0201可以作為尼羅羅非魚抗鏈球菌病選育的分子標(biāo)記，用于將來的抗病輔助育種。

5 全基因組抗病選擇育種研究

2001年Meuwissen等[117]提出了全基因組選擇的概念。用覆蓋全基因組的分子標(biāo)記進行輔助選育的手段，是對傳統(tǒng)標(biāo)記輔助選育的創(chuàng)新和改進，這已經(jīng)成為動物遺傳改良的研究熱點及運用到育種生產(chǎn)中的重要手段。其主要方法是通過全基因組中大量的高密度遺傳標(biāo)記估計出不同染色體片段或單個標(biāo)記效應(yīng)值，然后將個體全基因組范圍內(nèi)片段或標(biāo)記效應(yīng)值累加，從而獲得基因組估計育種值。目前，利用大黃魚基因組育種值篩選抗性親本取得了較好的效果[118]。所以全基因組測序及高密度遺傳圖譜的建立和遺傳育種值的預(yù)測模型在全基因組選擇技術(shù)中十分重要。

5.1 全基因組測序

國外對魚類全基因組測序的研究起步較早，始于20世紀(jì)90年代中期。2002年研究者完成第一個全基因組測序的魚類——紅鰭東方鲀Takifugurubripes[119]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的魚類全基因組被測序，如青鳉Oryziaslatipes[120]、斑馬魚Daniorerio[121]、虹鱒[122]和大西洋鮭[123]等28種魚類。

國內(nèi)對魚類全基因組測序的研究起步較晚，2014年，中國完成了半滑舌鰨的全基因組測序和精細(xì)圖譜的繪制[124]；同年，鯉的全基因組測序完成[125]。目前，研究人員已完成了包括4種灘涂魚Scartelaoshistophorus、Boleophthalmuspectinirostris、Periophthalmodonschlosseri、Periophthalmusmagnuspinnatus[126]，以及大黃魚[127]、草魚[128]、牙鲆[129]、鞍帶石斑魚Epinepheluslanceolatus[130]等共23種魚類的全基因組測序[131]。

5.2 基于SNP標(biāo)記的精細(xì)遺傳圖譜構(gòu)建

目前，多種魚類的高密度遺傳連鎖圖譜已構(gòu)建完成，如在牙鲆中構(gòu)建了12 712個SNP標(biāo)記平均間隔為0.47 cM的高密度遺傳連鎖圖譜，并定位得到9個與鰻弧菌抗性相關(guān)的QTL位點[85]。除此之外，團頭魴Megalobramaamblycephala[132]、中華鱘Acipensersinensis[133]、鳙[134]、鯉[135]等其他魚類的高密度遺傳連鎖圖譜也構(gòu)建完成[131]。

5.3 全基因組抗病育種研究

5.3.1 基于高通量測序技術(shù)的全基因組SNP位點的分型 隨著高通量SNP標(biāo)記檢測成本的不斷降低，以及基因分型和測序技術(shù)的發(fā)展，全基因組選擇技術(shù)開始被成功應(yīng)用于育種實踐當(dāng)中。目前，基于2b-RAD高通量測序的基因型分型技術(shù)已建立并被廣泛應(yīng)用[136]。采用2b-RAD方法進行基于SNPs的基因分型，可以有效地捕獲抗病力的遺傳變異[137-138]。根據(jù)草魚基因組SNP電子芯片對感染GCRV后的全同胞群體草魚中存活個體和死亡個體的基因分型進行基因組重測序，從篩選得到的具有顯著差異的1 822個基因型位點中獲得9個抗病相關(guān)基因和10個顯性等位基因位點，進一步采用高通量SNP分型技術(shù)篩選野生群體中攜帶抗病基因的草魚個體，以此為親本人工繁育出抗病群體[128]。降低基因分型成本的策略：1)選擇極端表型(EP)或預(yù)選擇SNP以構(gòu)建候選基因的低密度標(biāo)記，而且單標(biāo)記分析是預(yù)選擇SNP中節(jié)省候選基因分型成本的最可行方法；2)在基因組選擇中，利用極端表型選擇和單標(biāo)記分析相結(jié)合的方法，顯示出了較好的結(jié)果[139]。Wang等[140]也建立了一種高通量、低成本的基因型分析技術(shù)。

5.3.2 全基因組育種值的預(yù)測方法 在全基因組抗病育種技術(shù)研究過程中，研究人員開發(fā)了多種全基因組育種值預(yù)測方法(表5)。對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，所有全基因組育種值的預(yù)測方法精度都高于系譜的BLUP(P-BLUP)方法，其中，貝葉斯C(BayesC)的精度相對提高最多[141-142]。在大黃魚Larimichthyscrocea育種中，采用基于測序的基因分型構(gòu)建NGS測序文庫，得到約30 000個SNPs，根據(jù)擬合預(yù)測精度曲線估計基因組預(yù)測中特定性狀的算法達(dá)到理想預(yù)測精度所需的訓(xùn)練規(guī)模，并成功評估了預(yù)選擇SNPs的可行性[143]。目前，Dong等[144]開發(fā)了兩種新的大黃魚基因組育種值的計算策略：一種是針對非基于馬爾科夫鏈-蒙特卡洛算法(MCMC)的快速混合正態(tài)分布(FMixP)策略，另一種是針對基于MCMC的MixP(MMixP)策略。該研究中使用4種方法BayesA、BayesCπ、MMixP和FMixP來比較預(yù)測結(jié)果，結(jié)果表明，對于模擬數(shù)據(jù)，BayesCπ、MMixP和FMixP的性能優(yōu)于BayesA，F(xiàn)MixP在計算上比基于MCMC的方法快得多，但是所有方法對于大黃魚基因組育種值的預(yù)測能力都非常相似，該研究結(jié)果可能被應(yīng)用于基因組育種值預(yù)測中；另外，Dong等[145]還提出了一種計算速度明顯快于BayesC的快速貝葉斯C(fBayesC)方法，在基因組育種值預(yù)測上是可行的；該研究者還研究了對SNP基因型進行標(biāo)準(zhǔn)化與否條件下先驗超參數(shù)的兩種策略，并分別計算了7種預(yù)測模型(嶺回歸BLUP、BayesA、BayesB、BayesCπ、快速BayesB(fBayesB)、FMixP和MMixP)在兩種策略下的基因組育種值，提出了先進行SNP基因型標(biāo)準(zhǔn)化，再設(shè)定先驗分布參數(shù)值的建議[146]。“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種培育過程中，采用BayesCπ和GBLUP兩種算法進行獨立個體育種值估算，從而建立了抗病牙鲆品系的基因組選擇育種技術(shù)，成功培育出“鲆優(yōu)2號”牙鲆新品種[147]。對半滑舌鰨良種選育研究表明，通過BayesCπ模型進行全基因組選擇育種會取得較好效果，為通過芯片分型對半滑舌鰨全基因組選擇育種奠定了基礎(chǔ)[148]。

表5 全基因組選擇計算方法

5.3.3 基于全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選抗病相關(guān)SNP位點 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是篩選抗病相關(guān)SNP位點的重要手段。在鱸抗病研究中，采用一種簡化的高通量測序技術(shù)——限制性位點相關(guān)DNA測序方法得到了病毒性神經(jīng)壞死鱸的全基因組SNP數(shù)據(jù)，并對其進行GWAS，檢測了個體SNP與VNN抗性間的關(guān)聯(lián)[150]。對大西洋鮭的育種研究表明，基因組預(yù)測精度比傳統(tǒng)預(yù)測模型獲得的基因組預(yù)測精度高18%[151]。對大西洋鮭進行GWAS，獲得5個與抗AGD顯著相關(guān)的SNP位點[152]。在半滑舌鰨抗病性研究中，通過GWAS、Fst和核苷酸多樣性篩選結(jié)合的方法識別對抗病性重要的位點，在基因組重測序中鑒定的 1 016 774 個SNPs位點中檢測到 33 個與抗病性顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點[153]。

5.3.4 基于GWAS的QTL定位 采用GWAS法進行QTL定位，可以為魚類抗病提供有價值的候選基因。如采用GWAS法發(fā)現(xiàn)了4個與斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus的柱狀病抗性相關(guān)的QTL[149]，并發(fā)現(xiàn)了9個與斑點叉尾鮰愛德華氏菌Edwardsiellaictalurid免疫性相關(guān)的QTL[154]。在虹鱒中進行GWAS,檢測到10個與抗病相關(guān)的QTL[155]。在感染錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)鏡鯉的重要QTL或SNP周圍發(fā)現(xiàn)了許多與免疫相關(guān)的基因，包括tnfa、hif1a、galectin-8、rootletin和palladin，并利用公開的KHV感染鯉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了候選基因的表達(dá)模式，這為鯉對KHV抗性的遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了許多候選基因[114]。在鯉的LG 44上鑒定出一個與KHV抗性相關(guān)的QTL[156]。對虹鱒30 060個SNP進行GWAS，檢測到幾個QTL可能與抗冷水細(xì)菌病有關(guān)[157]。對大西洋鮭進行GWAS，在第二染色體的QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個可能與抗AGD有關(guān)的候選基因[152]。在大西洋鮭Ssa27和Ssa12染色體上發(fā)現(xiàn)兩個與心肌炎病毒(piscine myocarditis virus，PMCV)有關(guān)的QTL，其中包括多個免疫相關(guān)基因，如MHCⅡ類基因等[158]。

6 存在問題及展望

在世界范圍內(nèi)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展速度快于所有其他食用動物生產(chǎn)部門，但卻面臨著巨大的疾病感染風(fēng)險[4]。魚類病害種類多樣、病因復(fù)雜且傳播性強，解決病害問題并減少病害帶來的損失對整個水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)具有重要意義。近年來，隨著育種技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，育種水平不斷提高，傳統(tǒng)選育與分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)的結(jié)合，以及全基因組選擇模型的不斷優(yōu)化，動植物育種工作都取得了很大的進展，同時在魚類育種研究中也取得了一定進步。

6.1 抗病育種面臨的問題

1)魚類基因組資源開發(fā)發(fā)展迅速，但是后基因組時代，魚類基因功能研究包括抗病相關(guān)基因功能研究相對滯后。影響魚類基因功能研究的主要因素是相對于哺乳類，魚類工具細(xì)胞系的建立相對滯后，目前建立的細(xì)胞系普遍存在轉(zhuǎn)染效率低下的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了魚類基因功能的研究、驗證。另外，尚未建立以CRISPR/Cas9等為代表的基因組編輯技術(shù)和平臺，嚴(yán)重影響了重要抗病性狀關(guān)鍵基因的發(fā)掘及其在抗病育種中的應(yīng)用。

2)魚類抗病育種相關(guān)的基礎(chǔ)研究及抗病分子育種的研究相對滯后。目前，對魚類免疫系統(tǒng)的免疫機制研究還處于初級階段。對魚類免疫系統(tǒng)及其調(diào)控機制進行深入系統(tǒng)的研究，是推動魚類抗病育種的基礎(chǔ)，而抗病分子育種的研究是抗病育種的重要手段。

3)魚類抗病育種的基因組選擇研究尚處于初級階段。價格低廉的分子標(biāo)記篩選高通量分型平臺尚未建立，魚類抗病性狀的界定手段還無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，全基因組育種值的統(tǒng)計方法還處于摸索階段。

6.2 未來重點研究方向

1)魚類免疫系統(tǒng)的解析。由于魚類免疫知識的缺乏，限制了免疫系統(tǒng)進化研究、疫苗研發(fā)及抗病品種(系)的選育，因此，將來需要加強魚類免疫系統(tǒng)的解析研究，包括魚類先天免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的研究，同時也包括了免疫負(fù)調(diào)控因子的挖掘及其在先天免疫中作用機制的解析。

2)魚類全基因結(jié)構(gòu)解析及基因資源的深度挖掘。包括全基因組測序和精細(xì)圖譜構(gòu)建，魚類基因組的拼接、組裝和生物信息學(xué)分析技術(shù)，闡釋不同魚類基因組的結(jié)構(gòu)特征、進化規(guī)律和功能，進行基因資源的深度挖掘，包括參考基因組序列及其注釋(編碼和非編碼調(diào)節(jié)元件)、全基因組多態(tài)性標(biāo)記、高效基因分型平臺、高密度和高分辨率連鎖圖及轉(zhuǎn)錄組資源(包括非編碼轉(zhuǎn)錄本)。

3)加強魚類抗病性狀的遺傳解析及分子育種的基礎(chǔ)研究。借助基因組編輯平臺和魚類工具細(xì)胞系培養(yǎng)技術(shù)，篩選抗病性狀關(guān)鍵基因，研究和驗證基因的具體功能和調(diào)控機制，闡明基因?qū)共⌒誀畹臎Q定機制，解析抗病性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計育種奠定理論基礎(chǔ)；深入開展抗病性狀的GWAS和基因組選擇及分子設(shè)計的基礎(chǔ)研究，包括全基因組育種值的統(tǒng)計方法研究、分子標(biāo)記篩選的高通量分型平臺技術(shù)的建立(如抗病育種芯片)、魚類抗病性狀界定方法標(biāo)準(zhǔn)的建立；拓展抗病性狀相關(guān)分子標(biāo)記和關(guān)鍵基因的篩選與鑒定研究，建立基因與抗病性狀的關(guān)聯(lián)性；定位抗病性狀基因的QTL，明確基因型與抗病表型的關(guān)系。

4)確定抗病性狀遺傳和表觀遺傳調(diào)控。通過基因組甲基化分析、組蛋白修飾及小核糖核酸(RNA)分析等技術(shù)手段，解析環(huán)境因素介導(dǎo)的抗病性狀形成的表觀遺傳調(diào)控機制；建立甲基化修飾因子在水產(chǎn)動物中的檢測技術(shù)體系，篩選與抗病性狀相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記。