孟少東，姜新宇，葛恒，胡光耀，楊大佐，張家林* ，李強(qiáng)

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是引起鯽造血器官壞死癥的病原，具有較強(qiáng)的致病性[1]。流行病學(xué)表明，CyHV-2感染后會引發(fā)鯽出現(xiàn)體表、鰓出血，內(nèi)臟腫大出血[2]，鰾、下頜多處充血，眼球突出，眼球基部充血等癥狀[3]，對1齡幼魚具有強(qiáng)烈的致病性，嚴(yán)重威脅中國鯽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。然而，迄今尚缺少有效控制該病暴發(fā)的措施，對其發(fā)病機(jī)制也缺乏了解。

為逃避宿主的免疫攻擊，病毒在長期進(jìn)化過程中，發(fā)展出多種免疫逃逸策略阻斷宿主免疫應(yīng)答。其中，皰疹病毒等大分子DNA病毒，能通過編碼一些宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)蛋白類似物(如干擾素受體類似物、白介素類似物、腫瘤壞死因子受體類似物等)干擾宿主的免疫應(yīng)答，從而逃逸宿主的免疫清除[4]，這一類病毒編碼蛋白也被稱為病毒編碼受體(viroceptor)，其作用主要是阻斷和抑制細(xì)胞因子與其受體結(jié)合，從而抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，一些DNA病毒可編碼TNFR類似物(vTNFR)進(jìn)而參與病毒的復(fù)制過程，目前，兔纖維瘤病毒(Shope fibroma virus, SFV)[6]、新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)[7-8]和鯉皰疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)等[9-10]均有相關(guān)報道。

CyHV-2病毒隸屬于皰疹病毒目Herpesvirales魚皰疹病毒科Alloherpesviridae鯉皰疹病毒屬Cyprinivirus[11]。該病毒最早于1992年在患病金魚上發(fā)現(xiàn)，由于其是從鯉科魚類分離的第二種皰疹病毒，故被命名為鯉皰疹病毒Ⅱ型。在結(jié)構(gòu)方面，CyHV-2病毒具有魚類皰疹病毒的一般特征，病毒是一種較大的線性、雙鏈DNA 病毒，具有二十面體立體對稱的衣殼結(jié)構(gòu)，衣殼外為皮質(zhì)層和囊膜[12]。目前，CyHV-2的全基因組測序與注釋研究已經(jīng)完成，病毒基因組全長為290 304 bp，共編碼約154個潛在開放閱讀框[13]。

在CyHV-2基因組中，開放閱讀框4(open reading frame 4，ORF4)位于CyHV-2的反義鏈上，位置在ORF150～ORF151,其編碼一種具有TNFR結(jié)構(gòu)域的非結(jié)構(gòu)蛋白。有研究報道，此類蛋白可能在CyHV-2 的免疫逃避中發(fā)揮作用[14]，但其具體功能尚未見報道。本研究中，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化CyHV-2 ORF4重組蛋白，并通過小鼠免疫試驗分析其免疫原性，以期為進(jìn)一步研究 CyHV-2 ORF4蛋白的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠(生產(chǎn)許可證號:(遼)2013-0003)購自大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心。

pFastBac HTA質(zhì)粒、大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞、Sf9細(xì)胞(草地貪夜蛾細(xì)胞)、CyHV-2病毒由鹽城工學(xué)院水生動物免疫與疾病研究所保存。ExTaq酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；鼠抗6×His tag單抗購自武漢博士德生物工程有限公司；AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)公司；鎳離子瓊脂糖凝膠6FF預(yù)裝柱購自賽爾瑞成(北京)生命科學(xué)技術(shù)有限公司；CellfectinTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 CyHV-2ORF4基因的擴(kuò)增 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中CyHV-2ORF4基因序列(Gene ID: 14011391)，設(shè)計引物擴(kuò)增CyHV-2ORF4的編碼序列。其上游引物ORF4-F：5′GGAATTCGCCACCATGACACCTCCACCAACAACAC 3′；下游引物ORF4-R：5′CGGGTCGACAAGCTCTTCTGATGGA- GTGGGTGC 3′(下劃線處分別為酶切位點EcoRⅠ和SalⅠ)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以CyHV-2感染異育銀鯽的脾臟DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增CyHV-2ORF4基因片段。PCR反應(yīng)條件為： 95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性1 min，60 ℃下退火復(fù)性1 min，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行32個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.2 重組穿梭載體的構(gòu)建 將ORF4擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體上，挑取陽性克隆菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司使用通用引物(RV-M：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′；M13-47：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′)進(jìn)行測序。選取測序正確的陽性菌株，大量培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒小提，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ分別將pMD19-T-ORF4和pFastBac HTA載體進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用菌液PCR和測序鑒定后，獲得重組穿梭載體pFastBac HTA-ORF4。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡那霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)、IPTG/X-gal的藍(lán)白斑篩選平板上，37 ℃下倒置培養(yǎng)48 h。挑取白色菌落加入SOC培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)約3 h，按照通用引物(M13-F：5′CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3′；M13-R：5′AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′)進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽性菌株進(jìn)行重組桿粒DNA的提取，并命名為Bacmid-ORF4，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組桿狀病毒的獲得與鑒定 按照1×106個/孔的細(xì)胞數(shù)，將生長旺盛的Sf9細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。將上述陽性重組桿粒Bacmid-ORF4，采用CellfectinTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，3～5 d 后細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，為第一代重組桿狀病毒；用得到的P1代病毒繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，獲得P2代病毒；用P2代病毒繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，獲得P3代病毒。

將P3代重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞72 h后(同時設(shè)置空白細(xì)胞對照)，采用間接免疫熒光法(IFA)對重組桿狀病毒進(jìn)行鑒定。具體方法為：待轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)病變后，吸棄上清液并加入適量體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛。用含3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清蛋白(BSA)的PBS于37 ℃下封閉1 h，加入鼠抗6×His tag單抗(1∶500稀釋)為一抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗滌；以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶800稀釋)為二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗滌。用含抗熒光衰減淬滅劑的封片劑進(jìn)行封片，在倒置熒光顯微鏡(江南XD-202)下觀察分析。

1.2.4 重組CyHV-2 ORF4蛋白的純化 取P3代重組桿狀病毒感染72 h后的Sf9細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌，加裂解緩沖液(50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、5%甘油、10 mmol/L咪唑，pH 7.5)重懸，用超聲波破碎細(xì)胞(超聲10 s，停10 s，共進(jìn)行10個循環(huán))，4 ℃下以12 000 r/min 離心30 min，取細(xì)胞裂解上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，設(shè)置未轉(zhuǎn)染桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞為陰性對照。收集病毒感染的Sf9細(xì)胞裂解上清液，使用瓊脂糖凝膠6FF預(yù)裝柱，依照說明書進(jìn)行蛋白純化。采用BCA 法測定蛋白濃度，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Western blot分析 將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含3%BSA的PBS于4 ℃下封閉過夜，用鼠抗6×His tag單抗(1∶2 000稀釋)作為一抗，37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次5 min；使用AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶3 000稀釋)作為二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次5 min。最后使用BCIP/NBT顯色試劑盒于暗處顯色20 min，觀察有無棕色條帶出現(xiàn)。

1.2.6 重組CyHV-2 ORF4蛋白的免疫原性分析將6只BALB/c小鼠分為兩組，每組3只。對照組和試驗組均在第0、7、14、21和28天時通過尾尖采血制備血清，于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。在對小鼠取血清結(jié)束后，試驗組隨即對每只小鼠注射重組ORF4蛋白進(jìn)行免疫，對照組隨即對每只小鼠注射PBS緩沖液。免疫過程具體為：將純化的重組CyHV-2 ORF4蛋白溶液與弗氏佐劑混合(體積比為1∶1)后乳化，分別在第0、7、14、21天時以腹腔注射的方式免疫3只BALB/c小鼠，每只注射100 μg的ORF4蛋白(體積100 μL)，對照組每只小鼠注射100 μL PBS緩沖液。

以每孔1 μg重組ORF4蛋白包被酶標(biāo)板，使用間接ELISA方法檢測免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體的效價。以制備的免疫血清作為一抗(100 μL/孔，1∶100稀釋于PBS緩沖液中)，以AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶3 000稀釋于PBS緩沖液中)作為二抗，加入pNpp-Na發(fā)色液后，用酶標(biāo)儀測定405 nm波長下的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 CyHV-2 ORF4基因的擴(kuò)增

采用PCR法對CyHV-2ORF4基因進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在約1 000 bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶(圖1A)，進(jìn)一步將其克隆入pMD19-T載體上，經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后，得到了大小約1 000 bp左右的條帶(圖1B)，這與ORF4基因的片段(Gene ID：140111391)大小相符。測序結(jié)果也表明，擴(kuò)增片段與CyHV-2ORF4基因序列的一致性為100%。

M1—DL2000 DNA Marker；M2—DL5000 DNA Marker；1—PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2—重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-ORF4的雙酶切鑒定。

2.2 重組穿梭載體的構(gòu)建與鑒定

分別用M13F、M13R引物對重組桿粒Bacmid-ORF4進(jìn)行PCR 鑒定。從圖2可見，PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳后，在約3 500 bp處可見特異性條帶, 與預(yù)期片段大小相符，表明OFR4基因轉(zhuǎn)座成功。

M—DL10000 DNA Marker；1—重組桿粒DNA。

2.3 重組桿狀病毒的獲得

將重組桿粒Bacmid-ORF4轉(zhuǎn)染到處于對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞中。從圖3可見，轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)變圓、細(xì)胞核增大、邊緣變亮、部分細(xì)胞破裂等變化，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)良好，表明重組桿粒已成功轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞并生產(chǎn)出重組桿狀病毒。

A—正常Sf9細(xì)胞；B—轉(zhuǎn)染72 h后的Sf9細(xì)胞。

2.4 重組桿狀病毒的IFA鑒定

將P3代重組桿狀病毒接種到Sf9細(xì)胞72 h后，對重組桿狀病毒進(jìn)行IFA鑒定。從圖4可見，感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，而空白對照組未出現(xiàn)熒光，這表明外源ORF4蛋白在桿狀病毒中成功表達(dá)。

A—正常Sf9細(xì)胞；B—轉(zhuǎn)染72 h后的Sf9細(xì)胞。

2.5 重組ORF4蛋白的Western blot鑒定

將P3代重組桿狀病毒接種到Sf9細(xì)胞72 h后，收集感染細(xì)胞裂解上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并設(shè)置未感染細(xì)胞裂解上清液為對照。電泳圖譜顯示：在相對分子質(zhì)量約40 000 處出現(xiàn)了一條特異的染色條帶，表明重組桿狀病毒感染后的Sf9細(xì)胞成功表達(dá)ORF4蛋白；進(jìn)一步將細(xì)胞上清液進(jìn)行親和層析純化，Western blot結(jié)果顯示，純化產(chǎn)物能與抗His單抗發(fā)生特異性反應(yīng)(圖5)。

M—蛋白Marker IV；1—空白細(xì)胞對照；2—病毒感染Sf9細(xì)胞的裂解上清液；3—純化的ORF4蛋白；4—Western blot。

2.6 重組ORF4蛋白免疫原性分析

采用間接ELISA測定重組ORF4蛋白免疫小鼠第0、7、14、21、28天時血清中的特異性抗體效價。從圖6可見，與對照組相比，重組ORF4蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性抗體，且免疫組小鼠血清的效價隨時間的延長而升高，在免疫后第28天時，OD405 nm值達(dá)到1.5左右，而對照組的OD405 nm在0.1以下。

圖6 ORF4蛋白的免疫原性分析

3 討論

3.1 CyHV-2 ORF4蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

在與宿主長期共存的過程中，病毒進(jìn)化出多種逃逸宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制，從而逃避宿主對自身的識別和清除。迄今，已發(fā)現(xiàn)多種病毒免疫逃逸方式，包括干擾抗原呈遞途徑[15-16]、干擾抗病毒細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[17]、干擾受感染細(xì)胞的凋亡[18]及干擾免疫相關(guān)細(xì)胞的功能[19]等諸多方面。正是由于這些免疫逃避機(jī)制的存在，最終導(dǎo)致宿主無法控制病毒增殖而死亡。在CyHV-2病毒中，ORF4蛋白具有TNFR結(jié)構(gòu)域，其有介導(dǎo)病毒免疫逃逸的潛在作用。通過對CyHV-2 ORF4蛋白進(jìn)行深入研究，可為CyHV-2的致病機(jī)制和防控策略開發(fā)等方面提供理論依據(jù)。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性、結(jié)構(gòu)與功能特點、抗原性和免疫原性等與天然外源基因產(chǎn)物極其相似，且桿狀病毒具有高度的種屬特異性，對脊椎動物無感染性，其表達(dá)的產(chǎn)物具有較高的生物安全性[20]。本試驗中將ORF4擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pFastBac HTA質(zhì)粒(該質(zhì)粒攜帶His標(biāo)簽，可方便后期蛋白的表達(dá)鑒定及純化)，結(jié)果顯示，重組桿粒Bacmid-ORF4轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，出現(xiàn)了細(xì)胞變圓、細(xì)胞核明顯增大、部分細(xì)胞破裂等現(xiàn)象，這表明成功獲得了重組桿狀病毒(圖3)；IFA結(jié)果表明，外源蛋白在重組桿狀病毒感染的細(xì)胞中成功獲得了表達(dá)(圖4)；將感染細(xì)胞的裂解上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約40 000處有較弱的特異性條帶，這與ORF4蛋白的理論相對分子質(zhì)量相符；進(jìn)一步采用親和層析法進(jìn)行純化，成功獲得了較純的目的蛋白，Western blot結(jié)果顯示，該蛋白能與抗His單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，結(jié)合蛋白相對分子質(zhì)量分析，表明已成功利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)胞中表達(dá)CyHV-2 ORF4重組蛋白。雖然ORF4蛋白在細(xì)胞上清液中的表達(dá)量不高，但純化后蛋白純度和濃度可滿足進(jìn)一步試驗的要求。

3.2 CyHV-2 ORF4蛋白免疫原性分析

為檢測桿狀病毒表達(dá)的重組ORF4蛋白的免疫原性，將其免疫小鼠后在不同的時間點采血分離血清，并使用純化的重組ORF4蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示，免疫重組ORF4蛋白組小鼠血清效價隨時間延長而不斷升高，血清效價變化規(guī)律與李天增[21]、魏思琪[22]等的試驗結(jié)果相符。這表明，重組ORF4蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，且免疫后第28天的血清效價達(dá)到較高水平，重組ORF4蛋白具有良好的免疫原性。

4 結(jié)論

1)本試驗中以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為工具，構(gòu)建了Bacmid-ORF4重組桿粒并成功獲得P3代重組桿狀病毒。在P3代病毒感染的Sf9細(xì)胞超聲裂解取上清中成功獲得了高純度的重組CyHV-2 ORF4蛋白。

2)獲得的重組CyHV-2 ORF4蛋白表現(xiàn)出了較好的免疫原性，適合以其作為工具進(jìn)行CyHV-2 ORF4 蛋白的功能性研究。