王萌萌，王國強，米 佳，趙蕓蕓，張澤鵬，李曉敏，王秀閣*

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117 ；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021；3.長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院，長春 130117）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是一種排除診斷，非糖尿病性神經病可能存在于糖尿病患者中，對于臨床實踐，糖尿病多發(fā)神經病變的簡單定義是“排除其他原因后，糖尿病患者會出現癥狀和/或周圍神經功能障礙的體征”[1]。國際糖尿病聯盟指出，糖尿病患者在2030年將達到5.78億人，2045年將上升到7億人[2]。中醫(yī)藥治療DPN多靶點，副作用小。根據中藥的多靶點特點，我們通過體外實驗驗證芪枝渴痹通方（QZKBTF）對高糖誘導的大鼠雪旺細胞（RSC96）活性氧（ROS）含量及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株

大鼠永生化雪旺細胞株（RSC96）購于美國ATCC公司。

1.2 實驗藥物

芪枝渴痹通方（由黃芪、桑枝、豨薟草、全蝎、威靈仙等組成）購于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科。

1.3 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco，批號：2105325），胎牛血清（FBS）（Clark bioscience，批號：JC65116），青霉素（Genview，批號：9111310460），鏈霉素（Genview，批號：81224010250），碳酸氫鈉（北京化工廠有限責任公司，批號：20180531），SDS（BioFroxx；批號：EZ3414B217），鹽酸（北京化 工廠有限責任公司，批號：20181214），胰酶（BioFroxx；批號：EZ4567C127），葡萄糖（北京化工廠有限責任公司，批號：20180921），甘露醇（天津市福晨化學試劑廠，批號：20160302），噻唑藍（MTT）（北京化工廠有限責任公司，批號：TC2014120101），Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（貝博，批號：BB20051），活性氧檢測試劑盒（碧云天，批號：011520200402）。

1.4 實驗儀器

高級倒置相差顯微成像系統（尼康，型號：TS2），多功能酶標儀（TECAN，型號：Infinite M200 PRO），低速離心機（北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司，型號：LD5-10B），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，型號：371），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：DK-98-II），MM-1微型振蕩器（江蘇金壇金城國盛實驗儀器廠），CytoFLEX[貝克曼庫爾生物科技（蘇州）有限公司，型號：A00-1-1102]。

1.5 方法

1.5.1 細胞培養(yǎng)與分組 RSC96 細胞的培養(yǎng)條件：1）完全培養(yǎng)基，DMEM高糖培養(yǎng)基+ 1%青霉素、1%鏈霉素+10%胎牛血清；2）培養(yǎng)箱條件，37℃、5% CO2；3）細胞傳代，在細胞對數生長期，融合度80%左右傳代。細胞分組：1）構建DPN體外細胞模型，用不同濃度梯度的葡萄糖25、30、50、100、150、200 mmol·L-1作用于 RSC96細胞 48 h。2）排除滲透壓造成的細胞死亡，用不同濃度梯度的甘露醇 25、30、50、100、150、200 mmol·L-1作用于RSC96細胞48 h。3）不同濃度梯度的芪枝渴痹通方對RSC96細胞存活率的影響，25、50、100、150、250、500 μg·mL-1作用于 RSC96 細胞 48 h。4）芪枝渴痹通方對高糖誘導的ROS含量和RSC96細胞凋亡率的影響，空白組（Control）、高糖組（high glucose, HG）、芪枝渴痹通方組（150 mmol·L-1+芪枝渴痹通方 50、100、150 μg·mL-1）分別作用于RSC96細胞 24 h、48 h。

1.5.2 MTT法檢測細胞存活率 收集對數生長期的RSC96細胞，調整細胞懸液密度為6×103·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，加入濃度梯度的藥物100 μL，設置3個復孔，放入培養(yǎng)箱中孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察，48 h后每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入150 μL SDS，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，實驗時間結束后，使用490 nm測量各孔OD值，每次實驗重復3次。此方法用于檢測RSC96細胞存活率。

1.5.3 活性氧檢測 收集對數生長期的RSC96細胞，調整細胞懸液密度為5×104·mL-1接種于6孔板，每孔2 mL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。實驗時間結束后，用胰酶消化細胞，1 000 r·min-1離心5 min，按照1:1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFHDA，使最終濃度為 10 μL·L-1，每孔加入 1000 μL稀釋好的DCFH-DA重懸，37 °C細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使DCFHDA和細胞充分接觸。用不含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。洗滌完成后立即使用流式細胞系統測量熒光強度。每次實驗重復3次。

1.5.4 細胞凋亡檢測 收集對數生長期的RSC96細胞，調整細胞懸液密度為5×104·mL-1接種于6孔板，每孔2 mL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育48 h。實驗時間結束后，用不含EDTA的胰酶消化RSC96細胞，1 000 r·min-1離心5 min并收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞3次，離心后棄上清，收集細胞并用400 μL Annexin V結合液重懸細胞，細胞懸液中加入3 μL FITC，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min，加入3 μL PI，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，反應完成后立即使用流式細胞術測量熒光強度。每次實驗重復3次。

1.6 統計學方法

所有數據均使用GraphPad Prism 8.0（美國GraphPad Software公司）進行統計學分析，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的葡萄糖對RSC96細胞存活率的影響

如圖1所示，不同濃度的葡萄糖對RSC96細胞的存活率呈劑量依賴性降低。150 mmol·L-1濃度的葡萄糖降低了RSC96細胞28%的存活率，所以選擇150 mmol·L-1濃度的葡萄糖作為后續(xù)實驗最佳損傷條件；不同濃度的甘露醇對RSC96細胞的存活率無影響，可排除相同濃度的葡萄糖滲透壓影響的細胞存活率。

圖1 不同濃度的葡萄糖對RSC96細胞存活率的影響

2.2 不同濃度的芪枝渴痹通方對RSC96細胞存活率的影響

如圖2所示，25、50、100、150 μg·mL-1濃度的芪枝渴痹通方對RSC96細胞具有增殖作用，而250、500 μg·mL-1濃度對RSC96細胞有毒性，所以選擇50、100、150 μg·mL-1濃度的芪枝渴痹通方作為后續(xù)實驗的治療藥物濃度；與Control組比較，HG組可顯著降低RSC96細胞存活率（P＜0.001），與HG組比較，50、100、150 μg·mL-1濃度的芪枝渴痹通方可提高高糖誘導的RSC96細胞存活率（P＜0.01，P＜0.001）。

圖2 不同濃度的芪枝渴痹通方對RSC96細胞存活率的影響

2.3 芪枝渴痹通方對高糖誘導的RSC96細胞ROS含量的影響

如圖3示，不同劑量的芪枝渴痹通方可降低高糖誘導的RSC96細胞ROS含量，與Control組比較，HG組顯著升高高糖誘導的RSC96細胞的ROS含量（P＜0.001）；與HG組比較，不同濃度的芪枝渴痹通方可降低高糖誘導的RSC96細胞ROS含量，具有顯著性差異 （P＜0.01，P＜0.001）。

圖3 芪枝渴痹通方對高糖誘導的RSC96細胞ROS含量的影響

2.4 芪枝渴痹通方對高糖誘導的RSC96細胞凋亡率的影響

如圖4所示，不同劑量的芪枝渴痹通方可抑制高糖誘導的RSC96細胞的凋亡率。與Control組比較，高糖導致RSC96細胞發(fā)生凋亡（P＜0.001）；與HG組比較，不同濃度的芪枝渴痹通方可抑制高糖誘導的RSC96細胞的凋亡率（P＜0.001）。

圖4 芪枝渴痹通方對高糖誘導的RSC96細胞凋亡率的影響

3 討論

隨著糖尿病患病率的升高，相關并發(fā)癥的發(fā)病率逐漸上升。伊朗的一項橫斷面研究顯示，在57.5%的患者中發(fā)現了DPN[3]。斯里蘭卡的一項研究表明，根據糖尿病性神經病癥狀和多倫多臨床評分系統，DPN的患病率分別為48.1%和24.0%[4]。從人文和經濟角度來看，糖尿病及其并發(fā)癥都是沉重的負擔。全球衛(wèi)生組織支出的12%，即7 270億美元用于糖尿病及其并發(fā)癥，且繼續(xù)增長[5]。盡管投入很多人力及資金，但其治療效果仍然不能令人滿意。目前DPN的治療主要是控制血糖、對癥治療和疼痛管理[6-7]。DPN是導致足潰瘍和截肢的常見原因[8-9]。所以對于DPN及時干預治療很關鍵。DPN較高的發(fā)病率導致臨床負擔加重，疼痛癥狀往往難以治療，感覺喪失增加了足部潰瘍和下肢截肢的風險[10]。歐洲聯盟神經學會課題組和美國神經病學會指南建議使用抗驚厥、抗抑郁和阿片類藥物，可以緩解神經性疼痛，但不能遏制神經性疼痛帶來的痛苦[11]。DPN的治療有許多可用的選擇，但是如何評估療效及評價副作用還有很多局限性。中醫(yī)藥治療DPN彌補了其他療法的不足。在國內，中醫(yī)藥的發(fā)展呈上升趨勢，一項臨床觀察表明，參蝎止痛膠囊改善DPN疼痛癥狀比硫辛酸更安全有效[12]。一項動物實驗表明，中藥糖痛方可防治DPN，可能通過下調DPN大鼠坐骨神經PARP及NF-κB的表達水平來抑制周圍神經損傷的炎癥反應[13]。

芪枝渴痹通方具有益氣活血、化瘀通絡的功效。黃芪補氣升陽、行滯通痹，為方中君藥[14]。雞血藤補血活血、調經止痛、舒筋活絡，豨薟草祛風濕、利關節(jié)、解毒，二者共為臣藥，且與黃芪配伍，具有活血止痛通絡之功。威靈仙祛風濕、通經絡，桑枝祛風濕、利關節(jié)，全蝎熄風鎮(zhèn)痙、攻毒散結、通絡止痛，三者共為佐藥。牛膝逐瘀通經、補肝腎、強筋骨，現代藥理研究表明牛膝具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，為本方使藥[15-16]。

雪旺細胞是周圍神經中常見的神經膠質細胞，在DPN的致病機制中起著至關重要的作用[17]。DPN的主要特征是由雪旺細胞的凋亡導致脫髓鞘。本實驗表明，芪枝渴痹通方對RSC96細胞具有增殖作用。為了模擬高血糖癥，構建DPN體外RSC96細胞模型，使用不同濃度葡萄糖作用于RSC96細胞，為排除高血糖的高滲滲透性導致的細胞死亡，使用相同濃度的甘露醇作為對照。

ROS是生物體有氧代謝的副產物，可破壞細胞內的蛋白質、脂質和核酸，是對細胞有害的反應性物質，如果不及時清除，通常會出現在病理過程中，可損害具有氧化損傷的細胞和組織[18]。糖尿病持續(xù)高血糖會產ROS和亞硝化，二者是糖尿病并發(fā)大血管和微血管疾病的重要因素[19]。持續(xù)的高血糖會引起ROS水平升高，導致雪旺細胞線粒體損傷和細胞凋亡，繼而影響雪旺細胞的保護作用和神經修復的功能[20]。附子可以以劑量依賴的方式有效降低ROS的產生，改善高糖導致的低水平的線粒體膜電位，降低凋亡率[21]。本研究表明，高糖可導致RSC96細胞ROS含量增加，而在高糖條件下，芪枝渴痹通方有效抑制過量ROS產生，高糖導致RSC96細胞凋亡，而芪枝渴痹通方可抑制高糖誘導的RSC96細胞凋亡率，提高高糖誘導的RSC96細胞存活率，具有抗凋亡作用。

綜上所述，芪枝渴痹通方可通過降低高糖誘導的RSC96細胞ROS含量及凋亡率，減輕高糖對RSC96細胞損傷，對DPN神經損傷具有修復作用。