張今君 林剛建 夏慧麗

（臺(tái)州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江臺(tái)州318000）

井岡霉素是吸水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的一種水溶性抗生素，是1973年上海農(nóng)藥研究所從江西井岡山地區(qū)土壤中分離得到的[1]。井岡霉素屬于七碳氨基環(huán)醇類抗生素，在生物活性上表現(xiàn)為廣譜的抗真菌活性，具有良好的防治植物病害的作用。經(jīng)過(guò)40多年的農(nóng)業(yè)應(yīng)用，井岡霉素已經(jīng)成為最成功的生物源殺菌劑之一，年產(chǎn)超過(guò)6萬(wàn)t，產(chǎn)值超過(guò)4億元，可供近6 700萬(wàn)hm2使用[2]，目前井岡霉素在我國(guó)登記作物有水稻、小麥、草坪。近年來(lái)由于氮素化肥使用增加等原因，紋枯病在全國(guó)各茭白種植地普遍發(fā)生，井岡霉素開始用于茭白中紋枯病的防治工作，且效果良好[3～4]。但目前井岡霉素在茭白中的使用評(píng)價(jià)工作還未推進(jìn)[5]，有關(guān)茭白樣品中井岡霉素的檢測(cè)方法也未見(jiàn)報(bào)道，因此，本文建立茭白中井岡霉素殘留的檢測(cè)方法，以期為茭白中井岡霉素的使用評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

井岡霉素的檢測(cè)方法有薄層層析法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]、 氣相色譜法[8～9]、 液相色譜法[10～12]、 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[13～16]。薄層法用于定性分析，不能提供定量結(jié)果；毛細(xì)管電泳法檢出限為0.2 μg/mL，靈敏度較低；氣相色譜法測(cè)定井岡霉素需要衍生，過(guò)程繁瑣；液相色譜法中井岡霉素在210 nm處有最大吸收，多數(shù)物質(zhì)在此波長(zhǎng)下會(huì)有吸收，易引起基質(zhì)干擾，定性能力較差。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）將質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度與液相的高效分離能力相結(jié)合，近年來(lái)在農(nóng)藥檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，本文應(yīng)用固相萃取方法凈化，親水作用色譜（HILIC）分離，結(jié)合UPLC－MS/MS技術(shù)建立茭白中井岡霉素殘留量的檢測(cè)方法。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

1.樣品采集。茭白來(lái)自于市售。

2.標(biāo)準(zhǔn)品與試劑。井岡霉素（純度86.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國(guó)Merck）；去離子水，Milli－Q系統(tǒng)純凈水；Oasis HLB小柱，6 mL/200 mg，美國(guó)Waters公司。

3.儀器設(shè)備。QTRAP 5500三重四極桿－線性離子肼質(zhì)譜系統(tǒng)，美國(guó)AB Sciex公司；UPLC液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；Allegra X－30R冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；渦旋混勻器，德國(guó)IKA；2150 TH超聲波儀，上海安譜；PR 1602ZH/Z電子天平，奧豪斯電子天平有限公司。

（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。準(zhǔn)確稱取井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），用水溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， －18℃避光保存。

2.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，配制成濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4℃避光保存。使用時(shí)用水配制成合適濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。按優(yōu)化條件將稀釋成合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)試，以化合物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

（三）儀器條件

1.色譜條件。Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱，柱溫為35℃，流速為300μL/min，進(jìn)樣體積為5 μL，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

2.質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI源），正離子掃描（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）5 500 V；霧化氣壓力（GS1）50 psi； 輔助氣壓力（GS2）50 psi； 氣簾氣壓力（CUR）35 psi； 離子源溫度（TEM）500℃?；衔锒侩x子對(duì)498.2/178.2，定性離子對(duì)498.2/336.2，滯留時(shí)間100 ms，去簇電壓（DP）100V，定量離子對(duì)碰撞能量（CE）36 eV，定量離子對(duì)碰撞能量（CE）32 eV。

（三）凈化方式選擇稱取2.00 g（精確至0.01 g）粉碎均勻的空白樣品18份，分成3組，每組6份，置于50 mL離心管中，分別添加2.5、10.0、50.0、100.0、200.0μg/L井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，加入9 mL甲醇，振蕩離心后，移取上清液，上清液在45℃水浴中氮吹濃縮至2.5 mL以下待凈化。實(shí)驗(yàn)以空白樣品為對(duì)照，比較固相萃取、液液萃取、分散固相萃取3種凈化方式對(duì)茭白中井岡霉素回收率的影響，重復(fù)測(cè)定3次。

1.固相萃取法：提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)預(yù)先處理的Oasis HLB小柱，用2 mL水淋洗柱子，收集全部流出液和淋洗液，加水定容至5.0 mL，混勻，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)試。

2.液液萃取法：提取液加水定容至5.0 mL，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，棄去乙酸乙酯層，重復(fù)操作1次，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)試。

3.分散固相萃取法：提取液加水定容至5.0 mL，加入100mg PSA、100 mg C18，渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)試。

（五）實(shí)測(cè)樣品前處理

1.提取：稱取2.00 g（精確至0.01g）粉碎均勻的樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇，劇烈振蕩10 min，在4℃下6 000 r/min離心5 min，將上清液傾入15 mL離心管中，在45℃水浴中氮吹濃縮至2.5 mL以下待凈化。

2.凈化：將上述提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)預(yù)先處理的Oasis HLB小柱，用2 mL水淋洗柱子，收集全部流出液和淋洗液，加水定容至5.0 mL，混勻，過(guò)0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)試。

（六）基質(zhì)效應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別用水和基質(zhì)溶液稀釋成0.5、2.0、10.0、20.0、50.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測(cè)試，按照濃度和對(duì)應(yīng)峰面積繪制線性方程?；|(zhì)效應(yīng)按公式（1）計(jì)算。

公式（1）中，ME表示基質(zhì)效應(yīng)的大小，當(dāng)ME為正時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)，當(dāng)ME為負(fù)時(shí)為基質(zhì)抑制；Sm為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液斜率[17]。

二、結(jié)果與分析

（一）色譜條件的選擇實(shí)驗(yàn)比較了BEH C18和BEH HILIC兩種色譜柱對(duì)井岡霉素的保留能力和分離效果。用BEH C18分離時(shí)，井岡霉素在0.83 min出峰，響應(yīng)強(qiáng)度為3 900 cps，保留能力差，響應(yīng)較低；用BEH HILIC分離時(shí)，化合物保留能力及響應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)，出峰時(shí)間為3.25 min，響應(yīng)強(qiáng)度為6 040 cps。因?yàn)榫畬顾厥菢O性化合物，HILIC色譜柱配合高比例有機(jī)相流動(dòng)相可有效改善極性化合物保留行為，同時(shí)提高電噴霧離子化效率，靈敏度上升。實(shí)驗(yàn)又比較了a組乙腈∶0.1%甲酸水；b組0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸水；c組0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨水3組流動(dòng)相對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果顯示，a組流動(dòng)相中，色譜峰形拖尾，響應(yīng)較低；c組流動(dòng)相中色譜峰形對(duì)稱，但響應(yīng)強(qiáng)度只有1 400 cps；b組流動(dòng)相色譜峰形對(duì)稱且響應(yīng)強(qiáng)度高。因此本文選用BEH HILIC色譜柱配合0.1%甲酸乙腈∶0.1%甲酸水對(duì)茭白樣品中井岡霉素進(jìn)行分離。25μg/kg井岡霉素在兩種色譜柱及3組流動(dòng)相中的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 25μg/kg井岡霉素在兩種色譜柱及3組流動(dòng)相中的色譜圖

（二）凈化條件的選擇實(shí)驗(yàn)比較了固相萃取、液液萃取、分散固相萃取3種凈化方式對(duì)茭白中井岡霉素回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，可以看出，固相萃取法中5個(gè)添加水平井岡霉素的回收率均較高，不同濃度水平間重復(fù)性較好，平均回收率為102.9%，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為4.5%；液液萃取法回收率比固相萃取法低，5個(gè)濃度水平平均回收率為88.4%，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為9.6%；分散固相萃取法平均回收率為45.5%，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為11.5%。3種凈化方式中分散固相萃取法回收率最低，液液萃取法有機(jī)溶劑使用量較大，相比而言，固相萃取法溶劑使用量較少，且采用Oasis HLB色譜柱可有效去除茭白中蛋白、糖類等基質(zhì)干擾，減少基質(zhì)效應(yīng)。因此本文采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

圖2 3種凈化方式對(duì)回收率的影響

（三）線性方程及基質(zhì)效應(yīng)按上述實(shí)驗(yàn)方法配制0.5～50.0μg/L濃度范圍的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子峰面積對(duì)應(yīng)相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得各自線性方程，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，井岡霉素在0.5～50.0μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9?；|(zhì)效應(yīng)為0.3%，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)小，選擇純水配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（四）方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度利用茭白空白基質(zhì)進(jìn)行定量限的考察，以10倍信噪比確定井岡霉素定量限；在茭白空白基質(zhì)中分別按5.0、10.0、50.0μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，在5.0～50.0μg/kg濃度范圍內(nèi)，井岡霉素在茭白中的平均回收率為98.5%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～2.8%，方法定量限為5.0μg/kg。方法精密度和回收率均滿足GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》標(biāo)準(zhǔn)[18]要求。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表2 不同溶劑中線性方程及基質(zhì)效應(yīng)

（五）實(shí)際樣品測(cè)定應(yīng)用建立的方法對(duì)茭白樣品中的井岡霉素殘留量進(jìn)行測(cè)定，40批次樣品中檢出井岡霉素3批次，檢測(cè)結(jié)果分別為9.2、10.5和8.8μg/kg。

表3 井岡霉素的回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限等（n＝6）

三、結(jié)論

本文選用Oasis HLB小柱固相萃取凈化，BEH HILIC色譜柱分離，結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了茭白中井岡霉素殘留量的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，井岡霉素在0.5～50.0μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，3個(gè)添加水平的回收率范圍為98.5%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～2.8%，定量限為5.0μg/kg，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要求。本方法靈敏度高，選擇性好，適用于茭白樣品中井岡霉素的定性和定量檢測(cè)。