田松群，姚新轉(zhuǎn)，張寶會(huì)，呂立堂,*

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

茶樹(shù)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]，側(cè)枝上的芽葉是其主要的生產(chǎn)器官，豐富的葉芽數(shù)量是獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的關(guān)鍵因素[2]。茶樹(shù)的頂端優(yōu)勢(shì)很明顯，抑制了側(cè)芽的生長(zhǎng)，且茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育受干旱、冷脅迫等環(huán)境影響，制約茶園生產(chǎn)發(fā)展[3]。

細(xì)胞分類素(CKs)在消除頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)和促進(jìn)枝條生長(zhǎng)發(fā)育中有重要作用[4]。LONELY GUY(LOG)是植物激素細(xì)胞分裂素(CK)激活酶，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境脅迫中有重要作用[5,6]。研究表明，LOG酶指導(dǎo)莖節(jié)細(xì)胞分裂素的合成，促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)[7]。植物細(xì)胞分裂素在植物中以具有生物活性的游離堿形式存在，如iP、tZ形式[8,9]，結(jié)合物則活性較低或無(wú)活性，充當(dāng)儲(chǔ)存來(lái)源[10]。內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的合成酶有異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)和特異性磷酸氫水解酶(LOG)[11]，IPT首先合成CKs初始產(chǎn)物異戊烯基腺苷和順式玉米素核苷-5-磷酸，轉(zhuǎn)化為沒(méi)有生理活性前體物質(zhì)；LONELY GUY(LOG)是一種在細(xì)胞分裂素特異性磷酸酯水解酶反應(yīng)中將N6位修飾的腺嘌呤AMP衍生物轉(zhuǎn)化為腺嘌呤游離堿(細(xì)胞分裂素)和5-磷酸核糖的酶[12]，從而把前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有活性的細(xì)胞分裂素[13]。

目前，已鑒定9個(gè)擬南芥LOG基因、11個(gè)水稻LOG基因[14]，13個(gè)毛白楊LOG基因家族成員[8]。通過(guò)qRT-PCR對(duì)擬南芥莖、莖生葉等組織器官LOG表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)LOG基因在根和莖中表達(dá)，LOG8表達(dá)量最高[14]?；蚬δ苎芯勘砻鳎瑪M南芥LOG7抑制細(xì)胞分裂素的激活，影響莖尖分生組織的生長(zhǎng)，LOG7、LOG3和LOG4則對(duì)初生根生長(zhǎng)發(fā)揮作用；有研究表明：LOG多突變體使得芽和根系生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，其具有維持根尖缺陷分生組織的作用[15]；Chickarmane等研究表明AtLOG4在頂端和花序分生組織的表皮層中表達(dá)，AtLOG7在結(jié)節(jié)原基中表達(dá)，表明LOG可能起到在分生組織中指導(dǎo)細(xì)胞分裂素合成作用[16]；在水稻中，LOG功能的缺失會(huì)迅速終止側(cè)生分生組織的產(chǎn)生[17]；紫花苜蓿MtLOG1、MtLOG2與根瘤原基發(fā)育和側(cè)根形成有關(guān)[18]；Filippo Moramarco等研究結(jié)果推測(cè)，BP1253新型LOG響應(yīng)氧脅迫[19]。但目前對(duì)LOG響應(yīng)生物及非生物脅迫的研究還很少。

茶樹(shù)生長(zhǎng)受到干旱、低溫等多種逆境脅迫。關(guān)于茶樹(shù)LOG家族基因及其逆境相關(guān)的研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)茶樹(shù)LOG家族基因進(jìn)行基因組鑒定，并用鑒定到的茶樹(shù)、擬南芥以及楊樹(shù)LOG基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件等生物信息進(jìn)行分析，分析各組織及其逆境下的表達(dá)差異，為茶樹(shù)LOG家族基因及其抗逆響應(yīng)中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樹(shù) LOG 家族基因的篩選與序列分析

從茶樹(shù)(http://tpia.teaplant.org/)和擬南芥(https://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取茶樹(shù)和擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)、DNA、CDS、啟動(dòng)子序列、染色體定位信息[14]。以擬南芥9個(gè)LOG基因蛋白序列作為種子序列在TPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，篩選并獲得假定的茶樹(shù)LOG基因家族序列[11,14]。利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.janelia.org/)和NCBI保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)將所有獲得的推定的茶樹(shù)LOG基因序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的鑒定，剔除冗余序列，最終得到茶樹(shù)LOG基因。LOG基因的命名基于其與擬南芥基因同源度及染色體順序命名。用ExPASy Compute pl/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量(Mw)和等電點(diǎn)(pI)[20]。用PSORT工具(http://psort1.hgc.jp/form.html)植物來(lái)源預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和蛋白質(zhì)保守基序分析

在MEGA-X軟件中，使用近鄰連接方法(Boostrap=1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13,14]。通過(guò)MEME(http://meme-suite.org/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，motif數(shù)目設(shè)置為15個(gè)，motif寬度范圍設(shè)置為6～50氨基酸[21]。

1.3 染色體分布和啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用 HMM 3.0 軟件中的 perl 腳本從茶樹(shù)的基因組注釋信息中獲取CsLOG基因在染色體上的起始位置信息。在茶樹(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)截取CsLOG基因上游2kb基因序列，并通過(guò)PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)順式作用元件進(jìn)行分析[22]，最后利用 Tbtools 進(jìn)行可視化。

1.4 表達(dá)模式分析

根據(jù)鑒定出的茶樹(shù)CsLOG基因的編號(hào)，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)數(shù)據(jù)庫(kù)上下載它們?cè)诓铇?shù)不同組織(包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、莖、根)、鹽脅迫、PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫、茉莉酸甲酯處理和冷脅迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(TPM值)，利用TopHat和Cufflinks進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組reads的全基因組映射(Mapping)，計(jì)算各個(gè)CsLOG基因的FPKM值歸一化處理并使用Office軟件制圖[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)LOG基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

將比對(duì)的候選基因提交到SMART、Pfam、NCBI-CDD等在線網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，共鑒定到13個(gè)茶樹(shù)LOG基因，并根據(jù)基因在染色體的位置及其同源關(guān)系將其命名。進(jìn)一步對(duì)茶樹(shù)LOG基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析(表1)，結(jié)果顯示：茶樹(shù)LOG蛋白平均含有210個(gè)氨基酸殘基，其中CsLOG2a最短，含有153個(gè)氨基酸殘基；相對(duì)分子量為17.1(CsLOG2a)～24.52(CsLOG6a)kD之間；理論等電點(diǎn)(pI)介于4.62(CsLOG1a)～8.38(CsLOG1b)之間，同時(shí)發(fā)現(xiàn) pI<7的CsLOG蛋白達(dá)到 84.6%(11個(gè))，表明大部分CsLOG蛋白富含酸性氨基酸。11個(gè)基因成員定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，另外，LOG7a同時(shí)定位到細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，其余2個(gè)基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到線粒體基質(zhì)外，表明這3個(gè)基因可能在細(xì)胞中行使不同的功能。

表1 茶樹(shù)CsLOG基因家族基因的特征

2.2 茶樹(shù)LOG系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

為明確茶樹(shù)LOG家族成員的分類，將擬南芥LOG基因和楊樹(shù)LOG基因的蛋白序列和茶樹(shù)CsLOG蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CsLOG基因和擬南芥、楊樹(shù)同源性很高，表明LOG基因物種分化非常保守，蛋白序列的相似性表明這三個(gè)物種的LOG基因可能具有相似的生物學(xué)功能。根據(jù)擬南芥和楊樹(shù)的同源基因分類，將茶樹(shù)LOG家族分為兩個(gè)亞族(G1、G2)(圖 1)。CsLOG6a、CsLOG8a、CsLOG9a和擬南芥AtLOG8、AtLOG9為一簇(G1)，具有很高的同源性，其余基因成員為一簇(G2)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，LOG基因不僅在茶樹(shù)、擬南芥及楊樹(shù)中都存在，且同源性較高，表明LOG基因在物種分化過(guò)程中具有較高的保守性，進(jìn)化時(shí)間也要早于茶樹(shù)、擬南芥和楊樹(shù)的分化時(shí)間。

圖1 茶樹(shù)，楊樹(shù)和擬南芥LOG基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of LOGs in tea, poplar and arabidopsis

為深入了解茶樹(shù)LOG家族基因的功能，利用茶樹(shù)LOG基因組DNA序列和CDS序列對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖 2)。利用MEME軟件對(duì)茶樹(shù)LOG家族基因的保守基序組成和數(shù)目進(jìn)行分析，鑒定到7個(gè)比較保守的motif(motif 1～7)，另外每個(gè)基因都含有motif 1、motif 3、motif 4和motif 6。

圖2 茶樹(shù)LOG基因的系統(tǒng)進(jìn)化(A)，保守功能結(jié)構(gòu)域(B)，保守蛋白基序(C)和基因結(jié)構(gòu)(D)Fig.2 Phylogenetic relationships (A), conserved functional domain(B), the conserved protein motif(C), and basic gene structure (D) of LOGs in tea

2.3 染色體定位和啟動(dòng)子順式作用元件分析

根據(jù)茶樹(shù)基因組染色體注釋信息，將鑒定到的CsLOG基因進(jìn)行染色體定位(圖3)。結(jié)果顯示，茶樹(shù)LOG基因未分布到7條染色體(1、2、5、6、7、8和15號(hào))；2個(gè)CsLOG(CsLOG5b，CsLOG5c)基因不能定位到染色體上，其它11個(gè)CsLOG基因不均等地定位到不同染色體上，染色體最多含有3個(gè)LOG基因，為10號(hào)染色體，11號(hào)染色體含有2個(gè)，其余均僅含有1個(gè)CsLOG基因。說(shuō)明CsLOG基因在染色體上并非均勻分布。

圖3 茶樹(shù)CsLOG基因在染色體上的定位Fig.3 Localization of CsLOGs in chromosome of tea plant

本研究利用茶樹(shù)LOG基因上游2000 bp的基因組序列，對(duì)CsLOG基因順式作用元件進(jìn)行分析(圖4)。結(jié)果顯示，CsLOG啟動(dòng)子中鑒定出含有多個(gè)與光相關(guān)的元件，如G-box、Box 4、MYB類和TGACG-motif等。同時(shí)，與激素響應(yīng)相關(guān)元件的種類較多，如脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)，生長(zhǎng)素(auxin)等。另外還預(yù)測(cè)到大量響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件：干旱響應(yīng)元件MBS，厭氧誘導(dǎo)ARE，低溫，鹽脅迫DRE元件，低溫響應(yīng)元件LTR和防御和應(yīng)激反應(yīng)元件TC-rich repeats(圖4)，這些元件的存在表明LOG是植物反應(yīng)的重要調(diào)控因子。CsLOG3a、CsLOG1a、CsLOG2a和CsLOG9a等中呈多個(gè)富集現(xiàn)象，如CsLOG5b有干旱響應(yīng)元件兩個(gè)。對(duì)它們啟動(dòng)子中所含的順式作用元件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以看出，CsLOG中富含大量響應(yīng)激素類及非生物脅迫等的作用元件，說(shuō)明CsLOG與茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

圖4 CsLOG 基因的順式作用元件分析Fig.4 Prediction on cis-acting elements in CsLOGs注：low-temperature低溫脅迫；auxin生長(zhǎng)素響應(yīng)；anaerobic induction厭氧誘導(dǎo)；light responsive光響應(yīng)；salicylie acid水楊酸響應(yīng)；abscisic acid脫落酸響應(yīng)；gibberellin赤霉素響應(yīng)；MeJA茉莉酸甲酯響應(yīng)；dehydration, low-temp, salt stresses脫水低溫鹽脅迫；defense and stress防御與應(yīng)激脅迫；drought干旱誘導(dǎo)。

2.4 CsLOG基因在茶樹(shù)中的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步明確CsLOG在茶樹(shù)中的組織表達(dá)特異性，我們從TPIA中下載它們?cè)诓铇?shù)頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果等8個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組TPM表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)它們進(jìn)行分析。結(jié)果顯示(圖5)，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG5a、CsLOG8a及CsLOG9a、在各個(gè)組織中表達(dá)較為顯著。在老葉中CsLOG1(a/b/c)表達(dá)高；嫩葉及成熟葉CsLOG5a表達(dá)量最高；頂芽CsLOG5a、CsLOG6a和CsLOG9a相對(duì)表達(dá)量高；花CsLOG(8a、9a)表達(dá)較顯著，莖中CsLOG(5a、9a)表達(dá)高。以上結(jié)果表明，LOG基因在芽、葉和花中表達(dá)差異明顯。CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a及CsLOG7a等4個(gè)基因具有花表達(dá)特異性，CsLOG5(b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG2a及CsLOG7a在成熟葉中檢測(cè)不到表達(dá)。這說(shuō)明不同的CsLOG基因可能在茶樹(shù)的不同組織部位發(fā)揮作用。

圖5 茶樹(shù) CsLOG基因在頂芽、花、果、幼葉、成熟葉、老葉、根和莖表達(dá)模式Fig.5 Expressions of CsLOGs in apical buds, flowers, fruits, young leaves, mature leaves, old leaves, roots, and stems of tea plant

對(duì)CsLOG基因在干旱、鹽、冷及茉莉酸甲酯脅迫處理后的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，與其他基因的表達(dá)水平相比，CsLOG5a、CsLOG8a和CsLOG9a的表達(dá)量較高，其中上調(diào)基因(CsLOG5a和CsLOG9a)，下調(diào)有CsLOG1(a/b/c)，CsLOG6a和CsLOG8a；CsLOG2a和CsLOG7a不受干旱脅迫處理的調(diào)控(圖6A)。

在鹽處理下，CsLOG5a、CsLOG9a基因的表達(dá)量在鹽脅迫中上調(diào)，CsLOG8a上調(diào)，在處理48h后下調(diào)，CsLOG1(a/b/c)、CsLOG6a個(gè)基因下調(diào)；CsLOG2a、CsLOG7a不受鹽脅迫的調(diào)控(圖6B)。

在冷處理下，CsLOG5a和CsLOG8a的表達(dá)量被誘導(dǎo)微下調(diào)再上調(diào)，CsLOG1(a/b/c)持續(xù)下調(diào)，CsLOG2a、CsLOG3a、CsLOG4a和CsLOG7a不受冷處理的調(diào)控(圖6C)。

在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下，7個(gè)基因CsLOG1(a/b/c)、CsLOG3a、CsLOG4a、CsLOG5a、CsLOG6a表達(dá)量被誘導(dǎo)上調(diào)，而CsLOG5b、CsLOG5c和CsLOG9a表達(dá)水平下調(diào)，其中CsLOG8a在處理24 h前被下調(diào)，48 h上調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CsLOG2a和CsLOG7a表達(dá)變化不受MeJA處理的調(diào)控(圖6D)。

圖6 CsLOG基因在不同脅迫處理的表達(dá)模式Fig.6 Expressions of CsLOGs under various stress treatments

3 討論與結(jié)論

LOG基因家族已在多個(gè)物種中被鑒定。其中，楊樹(shù)13個(gè)[8]，桃7個(gè)成員[8]，水稻有10個(gè)[12]，大白菜17個(gè)[13]，擬南芥9個(gè)[14]，紫花苜蓿有6個(gè)[18]，草莓9個(gè)基因成員[25]。本研究基于全基因組共鑒定出13個(gè)茶樹(shù)CsLOG基因。11個(gè)基因成員定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與擬南芥AtLOG定位結(jié)果一致[14,24]，LOG7a同時(shí)定位到細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，其余兩個(gè)基因CsLOG5b和CsLOG5c定位到線粒體基質(zhì)外，說(shuō)明這三個(gè)基因可能在細(xì)胞中行使不同的功能?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，除LOG2a保守基序所在位置靠近N端以及內(nèi)含子數(shù)少外，LOG基因結(jié)構(gòu)高度保守。motif1為MHxRKAxMxFxALPGGYGTxxEE是LOG保守結(jié)構(gòu)域[14,22]，為L(zhǎng)OG蛋白特征序列，決定LOG蛋白功能[26]。

本研究表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CsLOG基因表現(xiàn)組織特異性。CsLOG9a、CsLOG5a、CsLOG8a、CsLOG1(a/b/c)在各個(gè)組織中表達(dá)較高。相對(duì)于其他組織CsLOG6a頂芽中表達(dá)最高，具有明顯的組織特異性；嫩葉及成熟葉中CsLOG5a表達(dá)量最高；老葉終CsLOG1(a/b/c)表達(dá)最高；花中CsLOG8a和CsLOG9a表達(dá)最高。綜上表明，LOG基因在頂芽、葉和花表達(dá)較高，結(jié)果與擬南芥大部分基因在根和莖中表達(dá)有差異[14]，芽的生長(zhǎng)會(huì)促進(jìn)后期花的發(fā)育，茶樹(shù)LOG基因可能參與芽及葉的生長(zhǎng)，而后促進(jìn)茶樹(shù)花生成。研究表明，細(xì)胞分裂素激活酶LOG是植物芽及根尖分生組織活性的重要調(diào)節(jié)劑[16]。組織特異性分析結(jié)果表明，CsLOG5a、CsLOG6a分別在葉及芽中特異性表達(dá)可能參與茶樹(shù)葉芽的發(fā)育及調(diào)控作用。

茶樹(shù)CsLOG基因參與響應(yīng)干旱、冷脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯脅迫響應(yīng)等。研究證明LOG與環(huán)境脅迫響應(yīng)相關(guān)，微生物中與LOG二型蛋白同源的結(jié)核分枝桿菌BpLOG酶與氧化應(yīng)激負(fù)調(diào)控相關(guān)，BpLOG突變菌株對(duì)氧化應(yīng)激敏感性低于野生型[19]。高等植物中，草莓FvLOG9個(gè)基因家族成員受干旱、高溫和高鹽脅迫調(diào)控，其中FtLOG1、FtLOG2、FtLOG5、FtLOG6和FtLOG9在各個(gè)組織中表達(dá)量均顯著高于其他基因[25]。CsLOG基因啟動(dòng)子順式作用元件分析CsLOG基因含有多種光調(diào)控相關(guān)元件，與草莓LOG基因家族一致[25]，可以推測(cè)光照與茶樹(shù)細(xì)胞分類素的含量密切相關(guān)[27]；CsLOG5a和CsLOG9a含有低溫，防御與應(yīng)激等非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件，在不同脅迫處理下，除低溫處理外CsLOG5a和CsLOG9a的相對(duì)表達(dá)量高。茶樹(shù)CsLOG基因不同脅迫的差異表達(dá)，推測(cè)CsLOG基因參與干旱、冷脅迫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯脅迫響應(yīng)。這些結(jié)果表明CsLOG廣泛參與茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物逆境脅迫響應(yīng)。

生物化學(xué)研究明確LOG基因編碼細(xì)胞分裂素激活酶，植物研究表明LOG基因在植物芽發(fā)育中具有重要調(diào)節(jié)作用[15,16]，本研究基于茶樹(shù)基因組鑒定出13個(gè)CsLOG基因，并分析其生物信息學(xué)特征，表達(dá)模式分析顯示CsLOG5a，CsLOG6a可能參與茶樹(shù)葉芽發(fā)育，CsLOG5a、CsLOG9a在不同脅迫下相對(duì)表達(dá)量較高，它們可能在茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要功能。然而茶樹(shù)LOG基因家族對(duì)激素及其逆境脅迫響應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探究其原理。