文│齊亞輝（陜西省動(dòng)物衛(wèi)生與屠宰管理站）

朱寶（陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

韓永剛（陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心）

馮樹濤（陜西省靖邊縣寧條梁區(qū)域農(nóng)牧工作站）

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟或古典豬瘟，是豬的一種急性、發(fā)熱接觸性傳染病，在自然條件下只感染豬。該病流行范圍很廣，而且致死率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。目前，豬瘟流行地區(qū)或國家主要采用接種C株弱毒疫苗的方法作為預(yù)防豬瘟的主要策略，但接種弱毒疫苗的傳統(tǒng)預(yù)防控制方法無法區(qū)別疫苗免疫抗體和自然野毒感染抗體，為了采用血清學(xué)方法凈化消滅豬瘟，新型基因標(biāo)記疫苗的研究已經(jīng)迫在眉睫。近些年陸續(xù)有國內(nèi)外研究者應(yīng)用分子生物學(xué)和基因工程方法，對(duì)豬瘟野毒株或弱毒株進(jìn)行基因修飾構(gòu)建出新毒株，其中以Erns（或E0）和E2為基礎(chǔ)構(gòu)建新毒株的方法占據(jù)著重要地位。有中國臺(tái)灣研究者利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)成功表達(dá)了重組豬瘟E2蛋白，并在其后的動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)中獲得成功。國內(nèi)研究者對(duì)亞單位疫苗的研究比較深入，一個(gè)商品化的桿狀病毒表達(dá)的重組E2亞單位疫苗已成功注冊，并推廣使用。此外，還有其他學(xué)者正在研究CHO表達(dá)E2等。

豬瘟C株活疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同強(qiáng)毒株和各種基因群的免疫保護(hù)，臨床保護(hù)率可達(dá)100%，被行業(yè)認(rèn)定為控制豬瘟的“金標(biāo)準(zhǔn)”疫苗。但是經(jīng)典的C株疫苗不能區(qū)分主動(dòng)免疫和自然野毒感染動(dòng)物，為了完成中國《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》及《國家豬瘟防治指導(dǎo)意見（2017—2020年）》中的到2020年年底，全國所有種豬場和部分區(qū)域達(dá)到豬瘟凈化標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)一步擴(kuò)大豬瘟凈化區(qū)域范圍的要求，新型豬瘟標(biāo)記疫苗將在凈化、消滅豬瘟的過程中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)前，規(guī)模豬場開展豬瘟凈化時(shí)，需要先成為豬瘟穩(wěn)定控制場，即在進(jìn)行豬瘟E2蛋白桿狀病毒重組滅活疫苗免疫6～8個(gè)月后的豬群中，完全清除所有豬瘟自然野毒感染產(chǎn)生的E0抗體陽性的豬只。可以看出，目標(biāo)豬場內(nèi)進(jìn)行豬瘟E2蛋白桿狀病毒重組滅活疫苗免疫是創(chuàng)建豬瘟穩(wěn)定控制場的一項(xiàng)必要步驟。因此，開展豬瘟病毒E2蛋白滅活疫苗及豬瘟C株活疫苗產(chǎn)品臨床免疫效果評(píng)價(jià)，是保證豬瘟免疫效果的必要工作。

漢臺(tái)區(qū)是陜西省漢中市政治、經(jīng)濟(jì)、文化中心，近年來隨著城鎮(zhèn)化快速發(fā)展，養(yǎng)殖用地逐年減少，生豬集約化飼養(yǎng)成為該區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的主攻方向。為此，開展不同豬瘟疫苗免疫效果評(píng)價(jià)，提高養(yǎng)殖場豬瘟防控水平，客觀評(píng)估疫情壓力及傳播風(fēng)險(xiǎn)，為經(jīng)典豬瘟防控提供技術(shù)支撐。

一、材料與方法

1.兩種豬瘟疫苗免疫方法。對(duì)比試驗(yàn)豬場為規(guī)模養(yǎng)殖場，母豬存欄量540頭。實(shí)行程序化免疫。

豬瘟E2滅活疫苗：母豬于2018年7月26日普免50頭，免疫劑量為2毫升/頭；保育豬免疫日齡30天，免疫98頭，免疫劑量為2毫升/頭；5號(hào)育肥圈育肥豬首次為30日齡免疫C株活疫苗，60日齡二免滅活疫苗2毫升/頭，免疫50頭。

豬瘟C株活疫苗（脾淋）：全場剩余母豬于2018年7月27日普免，免疫劑量為2頭份/頭；保育豬、育肥豬首免日齡30天，55日齡二免；5號(hào)育肥圈育肥豬首次為30日齡免疫C株活疫苗，60日齡二免豬瘟活疫苗2頭份/頭，免疫300頭。

母豬上述豬瘟疫苗均每間隔4個(gè)月加強(qiáng)1次。

2.樣品采集。按照總體隨機(jī)抽樣的方式，保育豬在75日齡進(jìn)行血液樣本采集；育肥豬在125日齡進(jìn)行采樣；母豬在10月21日（疫苗免疫后85天）進(jìn)行采樣。全血置室溫下自然凝固，分離血清于離心管中，編號(hào)后于－20℃保存待檢。本次共采集血清樣本母豬20份、保育豬20份、育肥豬20份；其中，豬瘟E2滅活疫苗、豬瘟C株活疫苗（脾淋源）各10份。

3.檢測方法。選用在疫苗免疫后早期抗體檢測中敏感性明顯高于進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒，而特異性與之沒有明顯差異的國產(chǎn)豬瘟間接ELISA試劑盒，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

4.儀器設(shè)備。Sunrise酶標(biāo)儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、普蘭德移液槍（10～100微升、20～200微升）八道移液器、超純水機(jī)、微量振蕩器、量杯、200微升一次性槍頭等。

5.檢測試劑。豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒，由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司提供，有效期20190917。

6.判定標(biāo)準(zhǔn)。

（1）試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)符合下列條件，方為有效：陰性對(duì)照OD450平均值應(yīng)≤0.20，本試驗(yàn)中陰性對(duì)照OD450平均值＝（0.090+0.087）/2＝0.0885≦0.20；兩孔陽性對(duì)照OD450平均值應(yīng)≥0.80，本試驗(yàn)中陽性對(duì)照OD450平均值＝（1.45+1.387）/2＝1.4185≥0.80。均符合試驗(yàn)要求條件，試驗(yàn)有效。

（2）結(jié)果的判定。陽性：樣品OD450值≥陽性對(duì)照OD450平均值×0.3，即CSFV抗體陽性。本試驗(yàn)陽性樣品判定條件為：1.4185×0.3＝0.4256；可疑：陽性對(duì)照OD450平均值×0.3≥樣品OD450值≥陽性對(duì)照OD450平均值×0.25，應(yīng)再進(jìn)行雙孔復(fù)試，若任意孔或兩孔均為陽性，則視為CSFV抗體陽性；若任意孔或兩孔均為陰性，則視為CSFV抗體陰性。本試驗(yàn)中：1.4185×0.3＝0.4256≥樣品OD450值≥1.4184×0.25＝0.3546為可疑；陰性：樣品OD450值≤陽性對(duì)照OD450平均值×0.25，即CSFV抗體陰性。本試驗(yàn)中：樣品OD450值≤1.4184×0.25＝0.3546為陰性。

7.數(shù)據(jù)處理。利用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平取0.05。

二、檢測結(jié)果

本次豬瘟疫苗免疫效果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

三、討論與分析

豬瘟疫苗不同生產(chǎn)工藝抗原含量差距較大，相應(yīng)工藝之間抗原含量標(biāo)示方法也有較大差異；本次選用種度代次較低的脾淋C株疫苗進(jìn)行對(duì)比；活疫苗可很快誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，免疫早期檢測不到中和抗體的情況下，豬卻能抵抗強(qiáng)毒的攻擊，說明免疫早期細(xì)胞免疫的作用更加重要。如果接種后晚些時(shí)間攻毒，豬群中和抗體水平與攻毒保護(hù)之間呈一定相關(guān)性。張東東、寧宜寶等研究顯示抗體中和檢測方法（FVNT）與間接ELISA檢測方法對(duì)免疫豬血清抗體由陰轉(zhuǎn)陽的檢出時(shí)間大致一樣，而與阻斷ELISA試劑盒相差較大，因此雖然本次僅對(duì)兩種疫苗各階段豬只免疫抗體的間接ELISA檢測結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)研究，但比較結(jié)果仍具有一定指導(dǎo)意義。

對(duì)比試驗(yàn)中豬瘟E2滅活疫苗與豬瘟（脾淋源）疫苗母豬、育肥豬、保育豬免疫抗體效價(jià)OD值數(shù)據(jù)經(jīng)兩樣本均數(shù)T檢驗(yàn)分析分別為：母豬，t＝9.1283、P＜0.001（t0.001＝3.922），差異極其顯著；育肥豬，t＝3.8511、P＜0.01（t0.01＝2.878），差異極顯著；保育豬，T＝2.5455、P＜0.05（t0.05＝2.101），差異顯著。

本次試驗(yàn)中豬瘟E2滅活疫苗與豬瘟（脾淋源）活疫苗免疫抗體效價(jià)OD值離散度分別為：母豬，7.08%、8.90%，差異不顯著；育肥豬16.09%、25.67%，豬瘟E2滅活疫苗免疫組整齊度更好；保育豬，24.83%、18.85%，豬瘟（脾淋源）活疫苗免疫組整齊度更好。

保育豬豬瘟E2滅活疫苗抗體效價(jià)OD值離散度大于（脾淋源）活疫苗加強(qiáng)免疫組，原因可能是本次試驗(yàn)中鑒于母豬是初次免疫豬瘟E2滅活疫苗，且仔豬豬瘟E2滅活疫苗免疫受母源抗體影響較小，為保持豬場免疫程序穩(wěn)定，仔豬豬瘟E2滅活疫苗免疫安排在30日齡（疫苗說明書推薦首免日齡為70日齡），根據(jù)疫苗說明書使用方法，之后未再進(jìn)行加強(qiáng)免疫；其次斷奶仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全也是原因之一，因此保育豬階段尚需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫效果對(duì)比。