張晶晶 嚴(yán) 鳴 盧 雯 徐 莉 王小青

(南京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京 210093)

0 引言

次氯酸根(ClO-)是一種重要的活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，廣泛存在于生物體內(nèi)[1-3]。內(nèi)源性ClO-可通過(guò)髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的催化作用，由過(guò)氧化氫和氯化物反應(yīng)生成[4]。ClO-由于具有強(qiáng)的氧化作用，可與各種蛋白質(zhì)側(cè)鏈和肽鍵發(fā)生反應(yīng)，并在先天性免疫中起重要的殺菌作用。另一方面，過(guò)量的ClO-會(huì)通過(guò)氧化含有硫醇、硫醚、血紅素蛋白和氨基基團(tuán)的生物分子從而導(dǎo)致靶細(xì)胞損傷和組織損傷[5-6]，引起各種心血管疾病[7]、神經(jīng)元退化[8]、關(guān)節(jié)炎[9]和癌癥等[10]。因此，發(fā)展能夠用于生命體內(nèi)的ClO-實(shí)時(shí)檢測(cè)的分析方法，對(duì)于理解ClO-的生理功能及其在相關(guān)疾病的發(fā)展中扮演的角色具有重要意義。

雖然人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了比色法[11]、電化學(xué)法[12-13]、化學(xué)發(fā)光法[14]等分析方法實(shí)現(xiàn)了體外ClO-的檢測(cè)，然而上述方法難以滿足生命體內(nèi)ClO-的實(shí)時(shí)檢測(cè)。另一方面，由于ClO-在體內(nèi)的半衰期短、擴(kuò)散距離小[15]，同時(shí)生命體內(nèi)存在如 H2O2、ONOO-、O2-等強(qiáng)氧化劑通常會(huì)干擾ClO-的檢測(cè)，這些影響因素使得人們對(duì)內(nèi)源性ClO-的專一性檢測(cè)變得尤為困難[15]。小分子熒光探針作為一種優(yōu)秀的檢測(cè)工具，由于其優(yōu)開(kāi)的選擇性和高靈敏度響應(yīng)以及實(shí)時(shí)分析成像等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為生命體系中相關(guān)生命物種檢測(cè)的一種有效方法[16-18]。鑒于ClO-在生物體中的重要作用及其實(shí)時(shí)專一性檢測(cè)的迫切需求，具有高靈敏高選擇性ClO-響應(yīng)的熒光探針的開(kāi)發(fā)也因此備受人們關(guān)注。

近年來(lái)，人們?cè)O(shè)計(jì)合成了多種特開(kāi)性檢測(cè)ClO-的熒光探針，并實(shí)現(xiàn)了生命體系內(nèi)ClO-的成像示蹤[19-24]。目前ClO-熒光探針的設(shè)計(jì)主要是利用ClO-對(duì)響應(yīng)基團(tuán)的選擇性氧化設(shè)計(jì)而成。常用的響應(yīng)基團(tuán)主要有硫族化合物(硫、硒、碲元素)[25]、碳碳雙鍵[26]、對(duì)甲氧基苯酚/胺及其衍生物[27]、羥胺或肟基[28]以及酰肼[29]等。ClO-易于將上述基團(tuán)氧化，使響應(yīng)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為相關(guān)的氧化產(chǎn)物，從而改變這些富電子基團(tuán)對(duì)熒光團(tuán)的電荷轉(zhuǎn)移或者光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，引起探針的熒光信號(hào)變化。雖然基于以上響應(yīng)基團(tuán)的熒光探針極大地豐富了ClO-檢測(cè)的手段，但需要指出的是，大多數(shù)探針仍存在響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、抗干擾能力差等缺點(diǎn)。例如Yang等報(bào)道的花青素染料熒光探針BR-1對(duì)ClO-的響應(yīng)時(shí)間大于30 min[30]。Shepherd和Sun等課題組報(bào)道的基于對(duì)甲氧基苯酚/胺氧化裂解機(jī)制的探針APF、HKOCl-1對(duì)ClO-的響應(yīng)時(shí)間大于5 min[31-32]。Wu等報(bào)道的基于C=C氧化機(jī)制的探針Py-Cy對(duì)于ClO-的響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 min[33]。Li和Liu等課題組報(bào)道的基于酰肼氧化的探針RPTPP和CC-ONOO容易同時(shí)受到過(guò)氧化亞硝酰等氧化物種的干擾[34-35]。因此，具有高靈敏、專一性響應(yīng)的ClO-探針的開(kāi)發(fā)仍然是化學(xué)家需要解決的問(wèn)題之一[30]。

在有機(jī)合成中，醛基可與羥胺反應(yīng)被保護(hù)為肟，在溫和條件下，肟可以被ClO-快速氧化，從而重新回到醛基的狀態(tài)[36]。與硫族、碳碳雙鍵、對(duì)甲氧基苯酚/胺及其衍生物等基團(tuán)的相對(duì)較慢的氧化反應(yīng)速率相比，肟與ClO-迅速反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間通常小于10 s[37]。因此，基于ClO-氧化肟基的檢測(cè)機(jī)制是用來(lái)構(gòu)建高靈敏響應(yīng)ClO-探針的常用策略之一。Lin等構(gòu)建了首例基于ClO-氧化脫除肟基機(jī)制的熒光探針Probe 1[38]。隨后人們?cè)谠撎结樀幕A(chǔ)上，通過(guò)選用不同的熒光團(tuán)及調(diào)控肟基被氧化的能力，獲得了性質(zhì)各開(kāi)的ClO-熒光探針[39-40]。然而需要指出的是，常見(jiàn)的肟基氧化后的基團(tuán)一般為醛基或酮基。這些基團(tuán)很容易在生成之后進(jìn)一步與生命體內(nèi)大量的含硫物種(如谷胱甘肽、半胱氨酸等)發(fā)生加成反應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光信號(hào)進(jìn)一步發(fā)生變化，干擾探針對(duì)于ClO-的檢測(cè)[41-42]。為克服含硫物種對(duì)于ClO-檢測(cè)的干擾，同時(shí)滿足ClO-實(shí)時(shí)快速檢測(cè)的需求，本研究中，我們通過(guò)將香豆素的內(nèi)酯羰基轉(zhuǎn)換為肟基，設(shè)計(jì)合成了一種新穎的ClO-探針Cou-HC。Cou-HC不僅可以在水溶液中選擇性地被ClO-快速氧化(響應(yīng)時(shí)間小于1 s)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)15倍，而且該氧化過(guò)程不受pH、活性氧、活性硫以及金屬離子等相關(guān)生理物種的影響。最為重要的是，氧化后所得到的香豆素可以穩(wěn)定存在，不會(huì)與含硫物種進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，從而避免了含硫物種對(duì)產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)帶來(lái)的干擾。我們還進(jìn)一步利用Cou-HC實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中內(nèi)源及外源性的ClO-的實(shí)時(shí)檢測(cè)，證明了Cou-HC在生命體系內(nèi)對(duì)于ClO-高選擇性實(shí)時(shí)檢測(cè)的能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

所有的試劑都直接購(gòu)買自商業(yè)公司，無(wú)需進(jìn)一步純化。柱層析硅膠粉購(gòu)買自青島海洋化工公司。1H和13C NMR譜在Bruker AVANCEⅢHD核磁共振儀上獲得。紫外可見(jiàn)吸收和熒光光譜分別在島津UV-1750的紫外分光光度計(jì)以及HORIBA Fluoromax-4熒光光譜儀上測(cè)得。質(zhì)譜數(shù)據(jù)從Bruker Daltonics micro TQF-QⅡ的高分辨質(zhì)譜(HRMS)測(cè)試得到。高效液相色譜(HPLC)采用島津LC-20A進(jìn)行。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)采用Zeiss LSM 710激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行。

1.2 Cou-HC及香豆素中間體的合成和表征

1.2.1 3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亞氨基-香豆素(1)的合成

取50 mL二口燒瓶，加入原料5-甲氧基水楊醛(1.9 g，13 mmol)和苯并噻唑-2-乙腈(2.3 g，13 mmol)，加入無(wú)水乙醇(10 mL)溶解，加入哌啶(130 μL，1.3 mmol)。將體系加熱至80℃，攪拌回流1 h，反應(yīng)結(jié)束。停止反應(yīng)，冷卻至室溫，有固體析出，抽濾得到產(chǎn)物并用無(wú)水乙醇洗滌，得到固體產(chǎn)物，產(chǎn)率為75%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ8.32(s，1H)，8.04(d，J=6 Hz，1H)，7.48～7.50(m，1H)，7.37～7.39(m，2H)，6.74(dd，J=6 Hz,1H)，6.68(d，J=6 Hz，1H)，3.86(s，3H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ163.4，155.2，141.7，136.2,130.5，129.9，126.4，126.3，125.2，122.9，121.4，113.9，112.5，111.5，100.5，100.4，55.8。

1.2.2 3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)的合成

取50 mL二口燒瓶，加入香豆素1(3.2 mmol)，加入4 mol·L-1HCl，60 ℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，將pH值調(diào)至中性，用CH2Cl2萃取3次，水洗5～6次(除去體系中的DMF溶劑)，用飽和食鹽水洗3次，柱層析分離提純，得到黃棕色固體0.60 g，產(chǎn)率為61%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ9.02(s，1H)，8.06(d，J=6 Hz，1H)，7.97(d，J=6 Hz，1H)，7.62(d，J=6 Hz，1H)，7.51～7.53(m,1H),7.40～7.42(m,2H)，6.92～6.96(m，2H)，3.93(s，3H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ164.3，160.5,160.2，156.0，152.5，141.7，136.6，130.5，126.4，125.1，122.6，121.7，116.8，114.0，112.7，100.6，56.0。

1.2.3 Cou-HC的合成

取50 mL二口燒瓶，加入香豆素1(1 g，3.2 mmol)，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(5 mL)溶解。將鹽酸羥胺(334 mg，4.8 mmol)和10% H2SO4(1 mL)溶于甲醇(5 mL)中，加入反應(yīng)體系中。將反應(yīng)體系加熱至90℃，攪拌回流3 h。停止反應(yīng)，冷卻至室溫，有黃色固體析出，抽濾得到產(chǎn)物并用無(wú)水乙醇洗滌，得到黃色固體0.59 g，產(chǎn)率57%。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ10.88(s，1H)，8.35(s，1H)，8.12(d，J=6 Hz，1H)，8.03(d，J=12 Hz，1H)，7.66(d，J=12 Hz，1H)，7.54(t，J=6 Hz，1H)，7.44(t，J=6 Hz，1H)，6.89(s，1H)，6.83(d，J=6 Hz，1H)，3.85(s，3H)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)：δ163.0，160.4，154.2，152.1，146.5，136.6,131.1，130.9，126.9，125.5，122.8，122.3，117.9，112.9，111.8，101.0，56.4。HRMS(ESI positive)：[M+H]+(C17H13N2O3S)m/z計(jì)算值：325.064 1，實(shí)驗(yàn)值：325.065 4。元素分析按C17H12N2O3S的計(jì)算值(%)：C 62.95，H 3.73，N 8.64；實(shí)驗(yàn)值(%)：C 62.99，H 3.80，N 8.53。

1.3 Cou-HC的光物理性質(zhì)表征

以DMF為溶劑，制備10 mmol·L-1Cou-HC濃儲(chǔ)備液。用CH3CN/phosphate緩沖液(PBS)稀釋原液(1∶9，V/V，pH=8，0.4%吐溫80)。Cou-HC在激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，狹縫寬度為1 nm的情況下記錄熒光光譜。選擇性響應(yīng)測(cè)試中所用活性氧物種參考文獻(xiàn)[18]配制。

1.4 Cou-HC的熒光量子產(chǎn)率

以香豆素6(3-(2′-苯并噻唑基)-7-二乙氨基香豆素)為標(biāo)準(zhǔn)品(在乙醇中，φstandard=0.8)，測(cè)定量子產(chǎn)率。對(duì)探針和香豆素6在0.01～0.05的吸光度范圍內(nèi)進(jìn)行吸收光譜的測(cè)量。根據(jù)以下公式計(jì)算量子產(chǎn)率：

其中φ是量子產(chǎn)率，∑F是積分熒光強(qiáng)度，A是在λex=400 nm處的吸光度，n表示溶劑的折射率。

1.5 生物細(xì)胞培養(yǎng)及成像

在含有10%胎牛血清、100 mL-1青霉素以及100 μg·mL-1鏈霉素的 Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)。細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5%的二氧化碳、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組。第一組是將細(xì)胞與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌3次，進(jìn)行細(xì)胞成像。第二組細(xì)胞用ABH(250 μmol·L-1)預(yù)處理4 h后洗去，再與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌，進(jìn)行細(xì)胞成像。第三組細(xì)胞用ABH(250 μmol·L-1)預(yù)處理4 h后洗去，再用NaClO(20 μmol·L-1)孵育 4 h，與 10 μmol·L-1Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗滌，進(jìn)行細(xì)胞成像。第四組細(xì)胞用ABH(250 μmol·L-1)預(yù)處理4 h后洗去，再與LPS(5 μg·mL-1)和 PMA(5 μg·mL-1)孵育12 h，然后與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌3次，進(jìn)行細(xì)胞成像。激發(fā)波長(zhǎng)405 nm，光譜波長(zhǎng)范圍為430～600 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cou-HC的設(shè)計(jì)與合成

香豆素類分子是一類經(jīng)典的熒光分子，因其具有發(fā)光效率高、波長(zhǎng)可調(diào)、生物兼容性好等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于熒光檢測(cè)與成像領(lǐng)域[43]。我們以3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)為發(fā)光母體，通過(guò)對(duì)其2位進(jìn)行肟基修飾，設(shè)計(jì)合成了Cou-HC。Cou-HC的合成如Scheme 1所示。5-甲氧基水楊醛與2-氰甲基苯并噻唑在哌啶的催化下縮合成環(huán)，得到3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亞氨基香豆素(1)。香豆素1與鹽酸羥胺在含有硫酸和N，N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中反應(yīng)可得Cou-HC。由于肟的C=N在激發(fā)態(tài)條件下的順?lè)撮_(kāi)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致分子熒光猝滅[40]，因此Cou-HC在PBS中的初始熒光較弱。而與ClO-反應(yīng)后，肟基被氧化水解，Cou-HC轉(zhuǎn)化為具有良好發(fā)光性能的香豆素2。因此，Cou-HC對(duì)ClO-的響應(yīng)將表現(xiàn)為明顯的熒光增強(qiáng)行為。另外，由于香豆素2的內(nèi)酯羰基穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于醛基，難以被谷胱甘肽等含硫物種加成，因此在生命體系內(nèi)，Cou-HC對(duì)ClO-響應(yīng)的熒光信號(hào)有望不受這些物種的影響。Cou-HC的結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜和元素分析進(jìn)行表征(圖S5～S7，Supporting information)。

Scheme 1 Synthesis and response mechanism of Cou-HC

2.2 Cou-HC的響應(yīng)機(jī)理

為了驗(yàn)證上述反應(yīng)的機(jī)理，我們采用HPLC對(duì)Cou-HC與ClO-之間的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了研究。如圖1 所示，Cou-HC(10 μmol·L-1)和香豆素 2(10 μmol·L-1)的甲醇溶液的吸收峰均為單峰，保留時(shí)間分別為4.2 min(Cou-HC)和 4.64 min(香豆素 2)。在探針溶液中加入ClO-后，探針溶液的HPLC譜圖在4.64 min處出現(xiàn)了新的吸收峰，與香豆素2的吸收峰一致，這一結(jié)果表明Cou-HC與ClO-反應(yīng)的過(guò)程中生成了香豆素2，與我們推測(cè)的反應(yīng)機(jī)理一致。

圖1 Cou-HC和香豆素2以及Cou-HC加入ClO-后的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of Cou-HC,coumarin 2 and Cou-HC treated with ClO-

2.3 探針的光譜性質(zhì)

所有的光物理性質(zhì)表征均在室溫條件下的CH3CN/PBS(1∶9，V/V，10 mmol·L-1，pH=8，含0.4%吐溫80)中進(jìn)行。首先，我們對(duì)Cou-HC的紫外可見(jiàn)吸收和熒光光譜分別進(jìn)行了測(cè)試，如圖2a所示，Cou-HC的最大吸收波長(zhǎng)為400 nm，摩爾消光系數(shù)為34 880 L·mol-1·cm-1。Cou-HC 的最大發(fā)射波長(zhǎng)在465 nm處，熒光量子效率為3.9%(圖2b)。

圖2 Cou-HC(5 μmol·L-1)在室溫下CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中的紫外可見(jiàn)吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Fig.2 UV-Vis absorption(a)and fluorescence emission(b)spectra of Cou-HC(5 μmol·L-1)in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature

為了研究Cou-HC對(duì)ClO-的熒光響應(yīng)行為，我們對(duì)Cou-HC進(jìn)行了ClO-的熒光滴定實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3a所示。從熒光光譜的變化可以看出，隨著ClO-濃度的增加，探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，增強(qiáng)倍數(shù)為15倍，且最大發(fā)射波長(zhǎng)從465 nm處紅移至480 nm。我們對(duì)465 nm處的熒光強(qiáng)度隨ClO-濃度增加的趨勢(shì)進(jìn)行分析可知(圖3b)，熒光強(qiáng)度的增加在ClO-濃度為10～50 μmol·L-1范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。當(dāng) ClO-的濃度增加至 70 μmol·L-1時(shí)，Cou-HC的熒光強(qiáng)度增加至最大，即使將ClO-濃度繼續(xù)增加至 100 μmol·L-1，熒光強(qiáng)度也基本保持不變。此時(shí)量子產(chǎn)率為66%，與香豆素2的量子產(chǎn)率基本一致，表明Cou-HC已全部轉(zhuǎn)化為香豆素2。根據(jù)檢測(cè)限計(jì)算公式LOD=3σ/k(n=3)，確定了Cou-HC對(duì)ClO-的檢測(cè)限為0.11 μmol·L-1(圖4，表S1)。與已經(jīng)報(bào)道的香豆素類肟基探針CMSH相比[28]，Cou-HC的檢測(cè)限較低，有高的量子產(chǎn)率，表明Cou-HC對(duì)ClO-具有較高的靈敏度，可以應(yīng)用于低濃度ClO-的檢測(cè)。

圖3 (a)室溫下Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中隨ClO-濃度變化的熒光發(fā)射光譜;(b)隨ClO-濃度變化的Cou-HC在465 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度Fig.3 (a)ClO- concentration-dependent fluorescence emission spectra of Cou-HC(5 μmol·L-1)in CH3CN/PBS(1:9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature;(b)ClO- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)

圖4 Cou-HC(5 μmol·L-1)在465 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度隨ClO-濃度變化的線性擬合曲線Fig.4 Linear fitting curve of ClO-concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)

2.4 Cou-HC的選擇性測(cè)試

Cou-HC的一個(gè)重要特征是它對(duì)于一種分析物具有特開(kāi)性檢測(cè)功能。為了考察Cou-HC對(duì)ClO-的特開(kāi)性檢測(cè)能力，我們測(cè)試了Cou-HC在生命體內(nèi)各種潛在干擾物質(zhì)存在下的熒光響應(yīng)(圖5a)。結(jié)果表明，ClO-的加入引起了明顯的熒光強(qiáng)度變化，Cou-HC的熒光光譜在最大發(fā)射峰處均有增強(qiáng)，加入其他分析物(50 μmol·L-1)后，Cou-HC的熒光強(qiáng)度并未發(fā)生明顯變化。同時(shí)，我們還測(cè)試了香豆素2在不同氨基酸中的熒光響應(yīng)。從圖5b中可以看出，香豆素2的熒光強(qiáng)度在氨基酸以及亞硫酸根等含硫物種的存在下保持穩(wěn)定。這一結(jié)果說(shuō)明香豆素2在生理?xiàng)l件下可以排除這些含硫物種對(duì)ClO-檢測(cè)的干擾。以上結(jié)果表明探針對(duì)ClO-具有高的選擇性響應(yīng)，有利于其在生命體系內(nèi)ClO-檢測(cè)的應(yīng)用。

圖5 (a)室溫下Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與10倍的ClO-和其他分析物反應(yīng)的熒光強(qiáng)度的變化;(b)香豆素2在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與不同氨基酸分析物反應(yīng)的熒光強(qiáng)度的變化,數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.,n=3Fig.5 (a)Fluorescent intensity changes of Cou-HC(5 μmol·L-1)with 10 eq.of ClO- and other analysts in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80);(b)Fluorescent intensity changes of coumarin 2(5 μmol·L-1)with amino-acid analysts in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80),Data are mean ±S.E.M.,n=3

2.5 Cou-HC反應(yīng)動(dòng)力學(xué)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)與對(duì)pH依賴性實(shí)驗(yàn)

為了研究Cou-HC與ClO-響應(yīng)的速率，我們進(jìn)一步考察了Cou-HC對(duì)ClO-的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)過(guò)程，測(cè)試結(jié)果如圖6a所示。結(jié)果表明，向含Cou-HC的PBS加入不同濃度的ClO-后，Cou-HC均能與ClO-立即反應(yīng)，響應(yīng)時(shí)間小于3 s，并在短時(shí)間內(nèi)基本保持穩(wěn)定。Cou-HC的響應(yīng)時(shí)間小于APF、HKOCl-1、Py-Cy等探針[31-33]，證明了Cou-HC對(duì)于ClO-的快速響應(yīng)能力。

我們還研究了Cou-HC在不同pH值(4.0～11.0)條件下對(duì)ClO-的響應(yīng)情況。如圖6b所示，Cou-HC的熒光強(qiáng)度在pH=4～11范圍內(nèi)高度穩(wěn)定，表明Cou-HC具有穩(wěn)定的非pH依賴的熒光特性。加入ClO-后，Cou-HC的熒光強(qiáng)度在pH=4～6范圍內(nèi)沒(méi)有明顯增強(qiáng)。這是因?yàn)榇温人崾侨蹼娊赓|(zhì)，在強(qiáng)酸中電離出來(lái)的ClO-會(huì)結(jié)合氫離子，生成弱酸，不穩(wěn)定，導(dǎo)致ClO-的濃度降低，進(jìn)而導(dǎo)致Cou-HC難以被氧化，從而表現(xiàn)不出明顯的熒光增強(qiáng)行為。在pH=10～11的堿性范圍內(nèi)，Cou-HC+ClO-體系的熒光強(qiáng)度與pH=8時(shí)相比略有降低。這可能是因?yàn)镃ou-HC的肟基在堿性條件下部分成鹽，導(dǎo)致Cou-HC的氧化程度降低。在pH=8時(shí)，Cou-HC+ClO-體系的熒光發(fā)射的強(qiáng)度增強(qiáng)最為明顯，增強(qiáng)倍數(shù)約為15倍，這與上述熒光滴定及動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 (a)Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中分別與不同濃度ClO-作用時(shí)在466 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨時(shí)間的變化;(b)Cou-HC在不同pH值的CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與ClO-反應(yīng)后在466 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化Fig.6 (a)Time-dependent emission fluorescent intensity of Cou-HC(5 μmol·L-1)at 466 nm with various concentrations of ClO- in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature;(b)Effects of pH value on fluorescent intensity at 466 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)after reacting with ClO- in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)

以上光物理性質(zhì)測(cè)試結(jié)果表明，Cou-HC對(duì)ClO-的響應(yīng)有靈敏度高、特開(kāi)性高、響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，具有應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)ClO-檢測(cè)及成像的潛力。

2.6 細(xì)胞成像

RAW 264.7是一種免疫細(xì)胞，是維持體內(nèi)平衡所必需的細(xì)胞種類之一，能夠產(chǎn)生次氯酸殺傷侵入體內(nèi)的病原體[44]。因此，我們進(jìn)一步選用該細(xì)胞研究了探針?lè)肿訉?duì)細(xì)胞內(nèi)ClO-的成像能力。

首先，將細(xì)胞與 Cou-HC(10 μmol·L-1)在 25 ℃下孵育30 min，然后通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡成像。由圖7a可以看出細(xì)胞內(nèi)部顯示出微弱的熒光，表明該化合物具有良好的細(xì)胞滲透性。我們分別用ABH(內(nèi)源性ClO-清除劑)和NaClO(外源性ClO-供體)處理細(xì)胞后，再與Cou-HC一起孵育30 min后進(jìn)行熒光成像，得到圖7b和7c。由圖7b可以看出，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度與7a相比有明顯的減弱，熒光強(qiáng)度下降約2倍。而圖7c細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯增強(qiáng)，強(qiáng)度與圖7a相比增強(qiáng)約6倍。從圖7c和7d可以看出，外源性NaClO的加入，使得細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而經(jīng)ABH處理之后，熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖7d)。因此，圖7c中熒光強(qiáng)度的變化是由ClO-與探針?lè)磻?yīng)引起。為了驗(yàn)證Cou-HC對(duì)ClO-成像的特開(kāi)性，我們用LPS/PMA(內(nèi)源性ClO-誘導(dǎo)劑)處理后的細(xì)胞進(jìn)行孵育。結(jié)果(圖7e)表明，加入誘導(dǎo)劑LPS/PMA后，熒光強(qiáng)度與圖7b相比增強(qiáng)約5倍。而經(jīng)LPS/PMA處理后的細(xì)胞進(jìn)一步用ABH處理后，熒光明顯降低至與圖7b類似的水平(圖7f)。以上成像實(shí)驗(yàn)表明，Cou-HC對(duì)ClO-具有優(yōu)開(kāi)的成像能力，可以對(duì)細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性的ClO-進(jìn)行特開(kāi)性檢測(cè)，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)ClO-可視化的效果。

圖7 Cou-HC在RAW 264.7細(xì)胞中的共聚焦熒光成像:(a)細(xì)胞與Cou-HC孵育;(b)將細(xì)胞用ClO-清除劑ABH(250 μmol·L-1,4 h)預(yù)處理,再與Cou-HC孵育;(c)用NaClO(20 μmol·L-1,4 h)處理細(xì)胞,再與Cou-HC孵育;(d)用NaClO(20 μmol·L-1,4 h)孵育,然后用ABH(20 μmol·L-1,4 h)預(yù)處理細(xì)胞,再與Cou-HC孵育;(e)用LPS(5 μg·mL-1)和PMA(5 μg·mL-1)處理細(xì)胞12 h,再與Cou-HC孵育;(f)用LPS(5 μg·mL-1)和PMA(5 μg·mL-1)預(yù)處理細(xì)胞12 h,用ABH(250 μmol·L-1,4 h)處理細(xì)胞,再與Cou-HC孵育;(g)圖a～f中的平均熒光強(qiáng)度,比例尺10 μm,數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.,n=3Fig.7 Confocal fluorescence imaging of probe Cou-HC in RAW 264.7 cells:(a)cells incubated with probe Cou-HC;(b)cells pretreated with ClO- scavenger ABH(250 μmol·L-1,4 h),and incubated with probe Cou-HC;(c)cells pretreated with NaClO(20 μmol·L-1,4 h),and incubated with probe Cou-HC;(d)cells pretreated with NaClO(20 μmol·L-1,4 h),then incubated with ABH(250 μmol·L-1,4 h),and then incubated with probe Cou-HC;(e)cells treated with LPS(5 μg·mL-1)and PMA(5 μg·mL-1)for 12 h,and then incubated with probe Cou-HC;(f)cells pretreated with LPS(5 μg·mL-1)and PMA(5 μg·mL-1)for 12 h,then treated with ABH(250 μmol·L-1,4 h),and then incubated with probe Cou-HC;(g)average fluorescence intensity in Fig.a～f,scale bar:10 μm,data=mean±S.E.M.,n=3

3 結(jié) 論

綜上所述，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種特開(kāi)性檢測(cè)ClO-的增強(qiáng)型熒光探針Cou-HC，其以香豆素為熒光團(tuán)，肟基為識(shí)別基團(tuán)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)ClO-靈敏、快速的特開(kāi)性識(shí)別。供電子基團(tuán)的引入使得Cou-HC的熒光發(fā)射增強(qiáng)至 15 倍，檢測(cè)限為 0.11 μmol·L-1，熒光量子產(chǎn)率增加了62%。此外，細(xì)胞成像研究表明，Cou-HC可以有效地進(jìn)行活細(xì)胞中的內(nèi)源和外源ClO-的低毒性成像。因此，Cou-HC在活細(xì)胞中ClO-的檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用前景。

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