黃武,李亞杰,亢帥,蒲云峰,侯旭杰*,郭芹,王強(qiáng)*
(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)
花生紅衣是花生精深加工過(guò)程中的副產(chǎn)物,產(chǎn)量較大,除用作動(dòng)物飼料以外,在其他加工領(lǐng)域未得到有效利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),花生紅衣中主要成分有水分(5%~9%)、蛋白質(zhì)(11%~18%)、脂肪(10%~14%)、粗纖維(37%~42%)、碳水化合物(12%~28%)、灰分(8%~12%)、單寧(7%)以及多種色素和硒、鋅、鈣、鉀、鐵等元素[1-2]。花生紅衣中多酚類(lèi)物質(zhì)含量為90 mg/g~125 mg/g,包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質(zhì)[3-4],其中原花青素是在熱、酸條件下能產(chǎn)生花色素的一種無(wú)色物質(zhì)。原花青素是一種很強(qiáng)的抗氧化物質(zhì),它在人體內(nèi)的抗氧化能力是維生素C的20倍,維生素E的50倍,可用作安全無(wú)毒的新型天然抗氧化劑[7-8]。若能充分利用花生紅衣中的原花青素,將會(huì)獲得較可觀的經(jīng)濟(jì)效益[9]。
利用超聲波、微波破碎植物細(xì)胞壁,可有效提升植物中功效成分的提取效率[10-12]。尤其是超聲輔助提取技術(shù)在植物有效成分提取中有較為廣泛的應(yīng)用,在花生紅衣的活性成分提取方面也有相應(yīng)的研究,王菲等[13]、陳洋[14]、童愈元[15]、管文荻[16]用超聲輔助提取花生紅衣中原花青素;林櫻姬等[17]、任虹等[18]用超聲輔助技術(shù)對(duì)花生紅衣中多酚進(jìn)行提取,并取得較好的結(jié)果,證明此技術(shù)適用于花生紅衣活性成分的提取。因此,本研究在超聲輔助提取的基礎(chǔ)上,結(jié)合水浴浸提以提高提取效果,并用正交試驗(yàn)優(yōu)化原花青素的提取工藝,為花生紅衣這一副產(chǎn)物的高值化開(kāi)發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。
花生紅衣:產(chǎn)地為山東,品種為四粒紅;無(wú)水乙醇、甲醇:天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司;香草醛(純度≥99%):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;4%香草醛-甲醇溶液:精確稱(chēng)取4.00 g香草醛用甲醇溶解并在100 mL容量瓶中定容;鹽酸:四川西隴化工有限公司;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):合肥博美生物公司。試劑均為分析純。
水浴恒溫振蕩器(SHA-B):江蘇金怡儀器科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-3000A):上海亞榮生化儀器廠;數(shù)控超聲波清洗器(SB-5200DT):寧波新芝生物科技股份有限公司;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ):鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;微型旋渦混合儀(WH-3):上海滬西分析儀器廠有限公司;數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋(EMS-20):金壇市科順儀器廠;電子天平(LE203E/02):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速冷凍離心機(jī)(TGL-20br):上海安亭科學(xué)儀器廠;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-2450):島津公司。
1.3.1 花生紅衣中原花青素的提取方法
稱(chēng)取干燥花生紅衣粉碎成粉末狀。用適量石油醚對(duì)紅衣粉末進(jìn)行脫脂:常溫下浸泡24 h,間歇攪拌,抽濾、烘干,得到花生紅衣脫脂粉末。精確稱(chēng)取1.0 g脫脂后的花生紅衣粉末與乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)40%~80%)按比例[1∶20(g/mL)~1∶60(g/mL)]混合,在 30 ℃~70 ℃下超聲處理10 min~50 min。參考王菲等[13]的方法,將超聲處理后的樣液轉(zhuǎn)入30℃~70℃水浴浸提30 min~70 min。然后將得到的溶液在4 000 r/min條件下離心10min,將上層澄清液取出,用無(wú)水甲醇定容至100mL。從中吸取1 mL樣液,用無(wú)水甲醇定容至10 mL,得到原花青素樣品待測(cè)液[19-22]。數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)所得平均值。
1.3.2 原花青素提取率的測(cè)定
1.3.2.1 原花青素的測(cè)定方法
鹽酸-香草醛法測(cè)定原花青素:準(zhǔn)確吸取3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸于試管中,再吸取樣品液0.5 mL,迅速混勻,在避光條件下進(jìn)行20 min顯色反應(yīng),測(cè)定吸光度[23]。
1.3.2.2 原花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定
精確稱(chēng)取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照鹽酸-香草醛法的條件反應(yīng)后,在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描,選擇最大吸收波長(zhǎng)。
1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
精確稱(chēng)取50 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品,用無(wú)水甲醇于50 mL容量瓶定容,得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,之后分別稀釋成 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL(注:如由 1 mg/mL得到0.1 mg/mL稀釋液,取1 mL 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液,再加入9 mL無(wú)水甲醇)這5個(gè)梯度,準(zhǔn)確量取0.5 mL各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別加入含3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL濃鹽酸的混合液中,快速混勻,避光條件下反應(yīng)20 min,于500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,空白對(duì)照為無(wú)水甲醇,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
1.3.2.4 原花青素提取率的計(jì)算
適當(dāng)稀釋原花青素提取液,按照1.3.2.1中方法測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)函數(shù)計(jì)算出樣品中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL),按照公式(1)計(jì)算出原花青素的提取率。
式中:C為原花青素質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;n為稀釋倍數(shù);m為花生紅衣粉末質(zhì)量,g。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn),選擇最佳工藝,因素水平如表1所示。
表1 正交試驗(yàn)L9(34)因素水平Table 1 Factor and levels of the orthogonal experiment L9(34)
在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)下進(jìn)行光譜掃描,原花青素最大吸收波長(zhǎng)光譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 原花青素最大吸收波長(zhǎng)光譜圖Fig.1 Spectrogram of the maximum absorption wavelength of procyanidin
如圖1所示,選擇出最大吸收波長(zhǎng)為500 nm。
根據(jù)原花青素標(biāo)品所測(cè)結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示。
圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of procyanidins
原花青素其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)函數(shù)為:y=1.176x+0.007,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8。式中:x為樣品中原花青素質(zhì)量濃度,mg/mL;y為吸光度。
2.3.1 水浴溫度對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定料液比1∶50(g/mL)、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,水浴時(shí)間50 min,考察水浴溫度對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖3。
圖3 水浴溫度對(duì)原花青素提取率的影響Fig.3 Influence of water bath temperature on extraction rate of procyanidins
如圖3所示,在30℃~50℃時(shí)提取率隨溫度升高而上升,50℃之后隨溫度上升提取率幾乎呈直線(xiàn)降低,原因可能是當(dāng)溫度超過(guò)一定數(shù)值時(shí),原花青素結(jié)構(gòu)受到破壞,使提取率下降,且水浴溫度越高所需能耗越大。因此,最適水浴溫度選擇為50℃。
2.3.2 水浴時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定料液比1∶50(g/mL)、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,水浴溫度60℃,考察水浴時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖4。
圖4 水浴時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響Fig.4 Influence of water bath time on extraction rate of procyanidins
如圖4所示,水浴時(shí)間在30 min~50 min期間,提取率隨時(shí)間增加而增加,時(shí)間達(dá)到50 min后,提取率隨時(shí)間變化不顯著,且略有下降趨勢(shì)。其原因可能是在水浴時(shí)間達(dá)到50 min后,原料中原花青素提取達(dá)到上限,因此提取率不隨時(shí)間增長(zhǎng)而增長(zhǎng),同時(shí)浸提液中原花青素在60℃下發(fā)生少量分解使提取率略有降低。綜上所得,水浴時(shí)間為50 min最佳。
2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定料液比1∶50(g/mL)、超聲時(shí)間 30 min、超聲溫度 30 ℃、水浴溫度60℃、水浴時(shí)間50 min,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖5。
圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響Fig.5 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins
如圖5所示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增高,原花青素提取率呈上升趨勢(shì),在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后,提取率開(kāi)始降低??赡苁怯捎陔S乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,極性增大,原料中醇溶性和脂溶性成分溶出率增加,使原花青素與乙醇-水分子結(jié)合率降低,從而使原花青素提取率降低。另外,高濃度乙醇使原料中蛋白質(zhì)等生物大分子變性沉淀,使原花青素溶出阻力增大,降低提取效果。體積分?jǐn)?shù)在60%和70%時(shí),提取率無(wú)顯著差異,綜合考慮,確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。
2.3.4 料液比對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度30℃、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間50min,考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖6。
圖6 料液比對(duì)原花青素提取率的影響Fig.6 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins
如圖6所示,原花青素提取效果隨料液比的增加呈先增大后降低趨勢(shì),料液比為1∶40(g/mL)時(shí)提取率最高。隨著溶劑含量上升,溶質(zhì)不斷從原料中析出,當(dāng)料液比達(dá)到1∶40(g/mL)時(shí),溶質(zhì)析出呈最高水平,繼續(xù)增加溶劑則使原料中各種雜質(zhì)析出,使原花青素提取率下降,另外,原花青素含量一定時(shí),溶劑體積增加使原花青素在溶液中濃度下降,使得提取率降低。因此,選擇料液比為1∶40(g/mL)最佳。
2.3.5 超聲溫度對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定料液比1∶40(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間30 min、水浴溫度60℃、水浴時(shí)間50 min,考察超聲溫度30、40、50、60、70℃對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖7。
如圖7所示,原花青素提取率隨溫度變化趨勢(shì)為先升高后降低,在40℃時(shí)達(dá)到最高。其原因可能是,溫度升高,分子動(dòng)能增大,原花青素快速大量溶出;溫度過(guò)高,部分原花青素被破壞,使提取率降低。由此確定最佳超聲溫度為40℃。
圖7 超聲溫度對(duì)原花青素提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of proanthocyanidins
2.3.6 超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響
稱(chēng)取1 g脫脂花生紅衣粉末,固定料液比1∶40(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度40℃、水浴溫度 60 ℃、水浴時(shí)間 50 min,考察超聲時(shí)間 10、20、30、40、50 min對(duì)原花青素提取效果的影響,見(jiàn)圖8。
圖8 超聲時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響Fig.8 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins
如圖8所示,原花青素提取率在超聲時(shí)間為20min時(shí)達(dá)到最高,此時(shí)原花青素已基本提取完全。超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能導(dǎo)致原花青素結(jié)構(gòu)被破壞,同時(shí),原花青素長(zhǎng)時(shí)間暴露空氣中易受氧化,使提取率下降。且長(zhǎng)時(shí)間超聲處理,增加能耗,延長(zhǎng)提取周期,增加提取成本,因此20 min為最佳超聲時(shí)間。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。探究各因素對(duì)原花青素提取效果的影響情況,并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。
如表3所示,F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果表明,4個(gè)因素對(duì)原花青素提取率的影響都不顯著。究其原因可能是本例試驗(yàn)誤差過(guò)大且誤差自由度?。▋H為2),使檢驗(yàn)的靈敏度低,從而掩蓋了考察因素的顯著性。由于各因素對(duì)提取率的影響都不顯著,因此不必再進(jìn)行各因素水平間的多重比較??芍苯舆M(jìn)行直觀分析。直觀分析法又稱(chēng)極差分析方法,通過(guò)比較各因素水平極差的大小,確定各因素主、次地位及最佳水平,極差越大,對(duì)原花青素提取率的影響越大[24]。如表2所示,極差分析結(jié)果表明,在ABCD這4個(gè)因素中,影響主次為C>D>A>B,說(shuō)明超聲時(shí)間(C因素)對(duì)原花青素提取率的影響最大,占影響因素43.38%,其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)(D因素),占影響因素28.68%,料液比(A因素)和超聲溫度(B因素)影響較少,分別占17.65%和10.29%。最優(yōu)條件為 A3B1C1D2,即料液比為 1∶45(g/mL)、超聲溫度 35℃、超聲時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)得到原花青素提取率平均值為9.07%。與正交試驗(yàn)最優(yōu)組結(jié)果相比有所增加,因此所得最佳提取工藝具有參考價(jià)值。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test
表3 各因素結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the results of various factors
本研究在經(jīng)過(guò)超聲波輔助提取后,再利用水浴浸提進(jìn)一步提高提取效果,并用正交試驗(yàn)對(duì)原花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。綜合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果,最終確定各因素對(duì)原花青素提取效果的影響主次依次為:超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>超聲溫度;最佳提取條件為:超聲時(shí)間15 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比 1∶45(g/mL)、超聲溫度 35℃、水浴溫度50℃、水浴時(shí)間50 min。在此條件下,原花青素最大提取率為9.07%,試驗(yàn)結(jié)果較單獨(dú)使用超聲提取或水浴浸提皆有所提高。本研究為花生紅衣這一副產(chǎn)物高質(zhì)化利用提供一定參考依據(jù),具有較好的應(yīng)用前景。