周青青，蔣豐嶺，王家妮，羅雅亭，程如越，沈曦，李鳴，何方

（四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610041）

近年來，隨著經濟的飛速發(fā)展和生活水平的提高，人們的生活方式、飲食結構也發(fā)生了很大的改變。同時，肥胖癥、心血管疾病、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）等代謝相關疾病逐漸成為威脅人類健康的主要因素[1]。目前的研究發(fā)現，除先天的基因影響，不健康的飲食習慣在代謝性疾病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[2]，比如已有研究表明高脂飲食和高脂高膽固醇飲食是誘導肥胖和非酒精性脂肪肝的重要風險因子[3]。

越來越多的證據表明，腸道菌群能夠調節(jié)膳食脂肪、脂溶性維生素的吸收，碳水化合物的分解及氨基酸合成等[4]，肥胖、NAFLD等代謝性疾病與腸道菌群結構的改變和多樣性失調關系密切[5]。研究顯示高脂、高膽固醇飲食會導致腸道菌群的結構發(fā)生變化，體現在擬桿菌門和雙歧桿菌水平下降，厚壁菌門和變形菌門水平上升。動物實驗和人體研究都有證據表明肥胖個體腸道中厚壁菌門與擬桿菌門比例（F/B）會增加[6-7]，而F/B的上升被認為是許多代謝相關疾病腸內細菌異常的重要特征[8-9]。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）和膽汁酸是腸道菌群的主要代謝產物。短鏈脂肪酸是含碳原子數6個及以下的揮發(fā)性有機脂肪酸，在腸道中乙酸、丙酸和丁酸的含量較高，具有保護腸黏膜屏障、提供能量、調節(jié)免疫、抗腫瘤等多種生理功能[10]。膽汁酸的主要作用是乳化脂肪，有利于脂溶性食物的消化吸收。研究表明，腸道菌群能夠通過激活核膽汁酸的法尼醇X受體（farnesol X receptors，FXR）信號通路調節(jié)膽汁酸代謝，促進NAFLD的發(fā)展[11]。因此，深入了解飲食對腸道菌群代謝產物的影響可進一步明確腸道菌群和宿主代謝性疾病的關系。

由于目前國內外的研究更多是關于高脂飲食與腸道菌群及機體代謝的關系，對含膽固醇的高脂高膽固醇飲食的比較研究還較少，因此，本研究擬采用高脂飲食和高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)小鼠，觀察不同飲食攝入對小鼠糖脂代謝、腸道菌群及其代謝產物的影響，為進一步闡明膳食與肥胖、NAFLD等代謝性疾病的關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙醚（色譜純）、無水乙醇（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；血糖試紙：上海羅氏制藥有限公司；高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、肝臟 TC、肝臟 TG 測定試劑盒：長春匯力生物技術有限公司；糞便細菌DNA提取試劑盒：北京天根生化科技北京有限公司；AMPure XT磁珠：美國Beckman Coulter公司；Qubit試劑盒：美國Invitrogen公司；Accu-Chek Active活力型血糖儀：上海羅氏制藥有限公司。

1.2 實驗動物及分組處理

四周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性BALB/c小鼠30只[許可證號：SCXK（川）2020-030]，購自成都達碩生物科技有限公司，小鼠飼養(yǎng)于四川大學華西公共衛(wèi)生學院實驗動物中心（實驗許可證號：SYXK2018-011），將小鼠隨機分為普通飲食組（normal diet，ND）、高脂飲食組（high fat diet，HFD）和高脂高膽固醇飲食組（high fat high cholesterol diet，HFHCD），每組10只，ND組采用普通飼料（三大營養(yǎng)素供能比分別為脂肪10%，碳水化合物70%，蛋白質20%）；HFD組采用高脂飼料（D12492，美國 Research Diets，三大營養(yǎng)素供能比分別為脂肪60%，碳水化合物20%，蛋白質20%）；HFHCD組采用高脂高膽固醇飼料（D12109C，美國Research Diets，三大營養(yǎng)素供能比分別為脂肪40%，碳水化合物40%，蛋白質20%），喂養(yǎng)12周至實驗結束。高脂飼料每4 057 kcal添加1 mg膽固醇，高脂高膽固醇飼料每4 057 kcal添加11.25 g膽固醇。

1.3 體重及臟器系數測定

每周測定小鼠體重。實驗結束后，準確稱量小鼠肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、腹腔脂肪。計算小鼠的臟器系數和脂體比。臟器系數=臟器重量（mg）/體重（g），腹腔脂肪脂體比=脂肪重量（mg）/體重（g）。

1.4 空腹血糖及口服葡萄糖耐量測定

小鼠禁食不禁水8 h，尾尖采血并用血糖儀測定小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）（0 min），后每只小鼠按體重經口灌胃2.0 g/kg葡萄糖，使用血糖儀測定灌胃后30、60、90、120 min的血糖值。

1.5 血脂和肝臟脂質測定

用全自動生化分析儀檢測血清高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）。肝臟組織經磷酸緩沖鹽溶液勻漿后離心處理，按試劑盒說明書測定肝臟TC、TG。

1.6 糞便細菌基因組DNA提取

收集小鼠糞便凍存于-80℃，按照糞便細菌總DNA提取試劑盒說明書的步驟提取糞便樣品中的DNA。

1.7 16SrDNA測序和生物信息學分析

將引物的5′端連上barcode和測序通用引物。在含有50 ng模板DNA的25 μL反應混合物（用ddH2O調整體系容積到25 μL）中進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，上游引物：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物：806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[12]，各 2.5 μL。反應體系還包括12.5 μL PCR染液。反應程序：98℃ 30 s；98 ℃ 10 s，54℃30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)。PCR 產物經AMPure XT磁珠純化后，經Qubit試劑盒定量和文庫檢測，使用 bcl2fastq（v1.8.4）和 FLASH 軟件（v1.2.11）對原始測序數據進行預處理，采用Qiime（v1.9.1）進一步分析序列，相似性在97%以上的序列將通過序列聚類得到操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并生成OTU表，同時，對OTU進行豐度、Alpha多樣性計算，以分析樣品內物種豐富度和均勻度信息。根據二代測序結果，分別在門、屬水平上選擇相對豐度大于0.1%的群落進行優(yōu)勢菌群分析。

1.8 糞便膽汁酸和盲腸短鏈脂肪酸檢測

每只小鼠取100 mg糞便，離心收集上清液，用液相色譜質譜儀檢測膽汁酸。收集小鼠盲腸內容物，取100 mg糞便于離心管中，加入內標（異己酸）溶液和乙醚固定，用氣相色譜法測定糞便中的乙酸、丙酸和丁酸含量。

1.9 數據處理與分析

采用Graphpad prism 7.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，服從正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，并采用單因素方差分析對服從正態(tài)分布的多組獨立樣本進行組間比較。p＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，檢驗均為雙尾。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重和血糖

不同飲食攝入組小鼠的體重變化見圖1。

圖1 實驗期間不同飲食攝入各組小鼠的體重變化Fig.1 Changes in body weight of mice in different diets during the experiment

由圖1可知，實驗期間3組小鼠體重穩(wěn)步增長，但差異不顯著。

對3組小鼠尾尖采血進行空腹血糖和口服葡萄糖耐量測定見圖2。

由圖2可知，HFD、HFHCD組小鼠0 min空腹血糖高于ND組（p＜0.05），30 min血糖ND組和HFD組均顯著高于 HFHCD 組（p＜0.05），且在 60、90、120 min血糖均呈現出HFD組顯著高于ND組和HFHCD組，差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。

圖2 各組小鼠口服葡萄糖耐量試驗測定結果Fig.2 Oral glucose tolerance test results of mice in each group

2.2 小鼠肝臟系數和脂體比

實驗結束后準確稱量各組小鼠肝臟和脂肪重量，計算所得的肝臟系數見圖3，脂體比結果見圖4。

圖3 各組小鼠肝臟系數結果Fig.3 Liver coefficient results of mice in each group

圖4 各組小鼠脂體比結果Fig.4 Liposome ratio of mice in each group

由圖3、圖4可知，HFHCD組小鼠的肝臟系數和脂體比均顯著高于ND組和HFD組（p＜0.000 1），而ND組和HFD組小鼠之間沒有統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。

2.3 小鼠血脂和肝臟脂質水平

實驗結束，用全自動生化分析儀檢測小鼠血脂水平見圖5，肝臟脂質結果見圖6。

圖5 各組小鼠血清HDL-C、LDL-C、TC、TG測定結果Fig.5 The determination results of serum HDL-C,LDL-C,TC and TG in each group of mice

圖6 各組小鼠肝臟TC、TG測定結果Fig.6 Results of determination of TC and TG in liver of mice in each group

由圖5可知，HFHCD組小鼠血清的 HDL-C、LDL-C、TC和TG水平均高于ND組和HFD組小鼠，HFD組和ND組小鼠的血脂水平差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。

由圖6可知，本次實驗中HFHCD組小鼠的肝臟TC含量顯著高于ND組和HFD組（p＜0.000 1）。HFD組小鼠的肝臟TG顯著高于ND組和HFHCD組（p＜0.01），HFHCD組與ND組的肝臟TG差異不顯著（p＞0.05）。

2.4 小鼠糞便腸道菌群多樣性與群落結構分析

2.4.1 小鼠糞便腸道菌群多樣性分析

主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）用于研究樣本群落組成的相似性或差異性，各組小鼠腸道菌群主坐標分析結果見圖7。

圖7 各組小鼠腸道菌群主坐標分析（PCoA）Fig.7 Principal coordinate analysis（PCoA）of intestinal flora of mice in each group

圖7中每個點表示一個樣本，相同形狀代表同一組，當同種形狀的點距離越近，不同形狀的點距離越遠時，表示不同組菌群結構差異越明顯[13]，由圖7可知，3組間群落遠遠分開，HFD、HFHCD和ND組均具有明顯差異。

Alpha多樣性分析能反映特定生態(tài)系統(tǒng)內微生物群落的豐富度和均勻度，采用Alpha多樣性分析指數進行統(tǒng)計，結果見表1。Observed_species指數和Chao1指數越大，說明菌群豐富度越高，Shannon指數越大，說明群落多樣性越高，PD_whole_tree指數越大說明菌群對進化歷史保存的差異越大。

由表1可知，HFHCD組小鼠的Shannon、Chao1、PD_whole_tree和Observed_species指數均顯著低于ND組和HFD組（p＜0.05），糞便菌群多樣性和豐富度均降低；與ND組相比，HFD組腸道菌群α多樣性相關指數有下降趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。

表1 α-多樣性指數（n=4/組）Table 1 α-Diversity index（n=4/group）

2.4.2 小鼠糞便腸道菌群群落結構分析

表2、表3分別表示3組小鼠腸道菌群在門水平、屬水平上的注釋結果。

表2 各組小鼠腸道菌群門水平相對豐度前六特征菌（n=4/組）Table 2 The top six characteristic bacteria in the relative abundance of the intestinal flora of each group of mice（n=4/group） %

表3 各組小鼠腸道菌群屬水平相對豐度前十特征菌（n=4/組）Table 3 The top ten characteristic bacteria in the relative abundance of the intestinal flora of each group of mice（n=4/group） %

由表2可知，在門分類水平上，ND組和HFD組小鼠優(yōu)勢菌由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門組成；HFHCD組小鼠的擬桿菌門相對豐度顯著低于ND組和HFD組（p＜0.05），而變形菌門、疣微菌門、放線菌門相對豐度、厚壁菌門和擬桿菌門比例顯著高于ND組和HFD組（p＜0.05），3組間厚壁菌門相對豐度無顯著差異。

由表3可知，在屬水平，與ND組相比，HFD和HFHCD組小鼠的普氏菌屬均顯著減少。HFD組的臭桿菌屬顯著高于ND組和HFHCD組。與ND組和HFD組相比，HFHCD組小鼠的擬桿菌屬、薩特氏菌屬、脫硫弧菌屬和艾克曼菌屬顯著升高；與HFHCD組比較，乳酸菌屬含量顯著高于HFD組，而與ND組無顯著差異。

2.5 糞便膽汁酸和盲腸短鏈脂肪酸

實驗結束后測定各組小鼠的膽汁酸水平，包括脫氧膽酸和膽酸兩項指標，結果見圖8。

圖8 各組小鼠膽汁酸測定結果Fig.8 Deoxycholic acid and cholic acid determination results of mice in each group

圖8顯示HFHCD組小鼠的脫氧膽酸、膽酸含量均顯著高于ND組和HFD組。

采集3組小鼠糞便，測定糞便中乙酸、丙酸和丁酸3種短鏈脂肪酸含量，結果見表4。

由表4可知，HFD組小鼠的丙酸、丁酸含量顯著低于ND組（p＜0.05），其它各組差異不顯著。

表4 各組小鼠糞便短鏈脂肪酸含量（n=3/組）Table 4 The content of short-chain fatty acids in the feces of mice in each group（n=3/group）

3 討論

本研究分別使用高脂飼料和高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)兩組實驗小鼠，模擬了當前較為普遍的西方飲食習慣。兩種飲食均導致小鼠空腹血糖顯著上升，且高脂飲食組小鼠的OGTT結果顯示，其60、90 min和120 min血糖均顯著高于普通飲食組和高脂高膽固醇組。Utzschneider等用高脂飲食誘導大鼠發(fā)生早期糖尿病癥狀時，其空腹血糖水平升高[14-15]。這些結果說明高脂飲食和高脂高膽固醇飲食均可導致小鼠血糖調節(jié)受損，且高脂飲食對糖代謝異常的影響強于高脂高膽固醇飲食。

肝臟是膽固醇代謝轉變的重要場所，本研究發(fā)現小鼠攝入的含量較高的脂肪和膽固醇不能被完全代謝，大量蓄積在腹腔脂肪和肝臟中，導致了機體肝臟膽固醇水平以及血脂水平異常。而單純攝入高脂飲食僅造成了肝臟甘油三酯蓄積，對整體的脂代謝影響并不顯著。付曉昉等研究發(fā)現長期高脂飲食不僅使小鼠脂代謝紊亂，還導致血清游離脂肪酸水平升高，多個組織器官發(fā)生胰島素抵抗[16]。這些結果表明高脂飲食導致的脂代謝異?？赡苄枰^長時間持續(xù)作用，而高脂高膽固醇飲食對于機體脂代謝和膽固醇代謝的影響是顯著的，且明顯強于高脂飲食，這可能與大量的膽固醇導致的肝臟代謝功能障礙有關。

高脂高膽固醇飲食顯著降低了腸道菌群α多樣性，在門水平上，HFHCD組小鼠腸道F/B較ND組和HFD組顯著升高。高F/B的個體從相同食物中獲得的能量較普通個體更高，高F/B已被證實與嚙齒類和人類肥胖相關[17]。高脂高膽固醇飲食顯著增加了小鼠腸道變形菌門含量，遠大于高脂飲食的影響，說明高膽固醇攝入可能更能誘導腸道變形菌門增加。在屬水平，HFHCD組乳桿菌屬較單純的HFD組顯著增加，與高脂高膽固醇飲食與NAFLD關聯性相一致。有研究發(fā)現在NAFLD患者與健康人群的比較中，患非酒精性脂肪肝病人群腸道中乳酸桿菌屬的種類有所增加，而瘤胃菌屬減少，乳桿菌可能與揮發(fā)性有機化合物如乙酸鹽和乙醇的產生有關[18]，這也許與肥胖和NAFLD的發(fā)病機制有關。高脂高膽固醇飲食還顯著降低了擬桿菌屬含量，使艾克曼菌屬（Akkermansia）顯著增加；與ND組相比，HFD和HFHCD組小鼠的普氏菌屬均顯著減少。研究表明，擬桿菌屬和普氏菌屬這兩種腸道細菌都與碳水化合物的分解能力有關[19]。Akkermansia能改善糖尿病小鼠的肝臟功能，降低葡萄糖和脂質代謝異常，減輕氧化應激，抑制炎癥反應[20]。這些結果表明高脂高膽固醇飲食可導致腸道菌群多樣性降低且群落結構異常，而高脂飲食對腸道菌群的影響較為有限。

SCFAs被證實可以直接影響宿主代謝，與腸上皮屏障功能及免疫系統(tǒng)密切關聯[21]，可能對肥胖及相關代謝紊亂有改善作用[22-23]，SCFAs減少可能導致葡萄糖和脂質代謝減弱、免疫力下降和腸道菌群多樣性減少。本研究中，只有高脂飲食引起小鼠丙酸、丁酸含量較普通飲食組顯著減少，而高脂高膽固醇飲食對SCFAs產量無顯著影響，表明小鼠腸道SCFAs代謝可能對膳食脂肪更為敏感，而與膽固醇的含量無明顯關聯。

膽汁酸能夠調節(jié)機體膽固醇的水平，Yoshimoto等[24]研究表明，肥胖動物腸道中增加的脫氧膽酸可以與腸道細菌結合，通過腸肝循環(huán)到達肝臟，可誘導肝組織的炎癥和腫瘤的發(fā)生。本研究中，HFHCD組小鼠的脫氧膽酸、膽酸含量均顯著高于ND組和HFD組，說明膽固醇的添加促進了腸道內次級膽汁酸的生成，這可能與改變的腸道菌群結構有關，即高膽固醇飲食可能富集了腸道內代謝膽汁酸的細菌。NAFLD的發(fā)病機制目前尚未完全明確，但多項研究表明其與飲食、腸道菌群和膽汁酸水平相關。Devkota等[25]的研究表明，飲食中的脂肪酸能夠通過改變膽汁酸池中的膽汁酸成分，進而使腸道菌群發(fā)生改變。

4 結論

綜上所述，本研究結果進一步顯示了飲食對機體糖脂代謝、腸道菌群及其代謝產物的影響。高脂高膽固醇飲食導致小鼠腹腔脂肪蓄積、血脂、肝臟脂質和膽固醇代謝異常，腸道菌群多樣性降低且群落結構紊亂以及腸道內次級膽汁酸的增加；而高脂飲食造成了糖代謝異常、肝臟甘油三酯的顯著升高和腸道菌群結構的輕度異常以及丙酸、丁酸含量的降低。表明高脂飲食和高脂高膽固醇飲食都是代謝性疾病的危險因素，且高脂高膽固醇飲食的影響可能更大，再次證明了飲食、腸道菌群與代謝性疾病的密切關系。同時表明不同飲食成分可通過不同的作用機理影響肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的發(fā)生。因此飲食相關的代謝性疾病防治上需要根據不同的飲食內容制定不同的對策，但各種飲食相關的代謝性疾病在腸道菌群方面的發(fā)病機制還需要進一步研究。