任多多，邵紫君，劉松鑫，王澤帥，趙麗娟，夏蘊(yùn)實(shí)，李珊珊，孫印石,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118）

抗生素相關(guān)性腹瀉[1]（antibiotic associated diarrhea，AAD）是指在使用抗生素時發(fā)生的其他原因不明的腹瀉，其中腸道菌群失調(diào)是AAD 的一個重要特征[2]。腸道菌群作為一個新的“器官”，其與機(jī)體的營養(yǎng)、免疫、代謝等諸多生理功能息息相關(guān)，在維持機(jī)體健康穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[3]。腸道菌群與機(jī)體之間相對平衡的關(guān)系[4]被打破，就會引起腸道菌群紊亂使宿主處于疾病狀態(tài)之中。

已有文獻(xiàn)報道，許多植物多糖可以促進(jìn)腸道益生菌群的生長、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，維持腸道健康的內(nèi)環(huán)境。納米山藥多糖雙歧桿菌合生元結(jié)腸靶向微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[5]能夠提高腸炎大鼠的免疫功能。黃芪多糖和人參多糖能增強(qiáng)仔豬的免疫力，促進(jìn)腸道菌群的平衡，進(jìn)而提高仔豬腸道的健康[6]。鐵皮石斛多糖通過提高糞便含水量和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）含量調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，從而促進(jìn)免疫低下小鼠的腸道健康[7]。相關(guān)研究表明人參多糖[8]、五味子多糖[9]、黃芪多糖[10]、葛根多糖[11]、百合多糖[12]等都具有調(diào)節(jié)因鹽酸林可霉素導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)問題，并具有維持腸道健康的作用。不同的植物多糖大都可通過促進(jìn)腸道有益菌群的生長，抑制有害菌的增殖起到調(diào)節(jié)腸道菌群的積極作用。西洋參（Panax quinquefoliumL.）是五加科多年生草本植物西洋參的干燥根，別名花旗參、美國參等，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效[13?15]。現(xiàn)代藥理研究表明，西洋參多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[16]。西洋參中含有糖類、皂苷、揮發(fā)油和多肽等多種功能成分，其中多糖是西洋參發(fā)揮藥用價值的重要活性成分，不斷受到人們的關(guān)注和重視，在發(fā)揮療效的過程中起著不可或缺的作用[17?18]。目前，關(guān)于西洋參多糖對抗生素相關(guān)副作用的影響還未見報道。

克林霉素磷酸酯與林可霉素相比其抗菌作用強(qiáng)4～8 倍，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌具有良好的抗菌活性，同時對各類厭氧菌具有強(qiáng)大的抗菌作用，其抗菌譜廣，臨床應(yīng)用比較廣泛。因此本實(shí)驗(yàn)通過建立克林霉素磷酸酯致抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠模型，采用常規(guī)HE 染色、16S rRNA 高通量測序等方法，研究了WQP 對抗生素相關(guān)副作用，尤其是腹瀉、腸道結(jié)構(gòu)損傷、腸道菌群組成和多樣性的影響。實(shí)驗(yàn)旨在采用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步研究西洋參多糖是否對克林霉素磷酸酯造成的腸道菌群紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而為西洋參多糖的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參（Panax quinquefolium） 吉林撫松豐澤農(nóng)業(yè)種植開發(fā)有限公司；Wistar 健康雄性大鼠 24 只，重量為（140±20）g 遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001，合格編號211002300 047566；克林霉素磷酸酯（批號1903190911） 辰欣藥業(yè)股份有限公司；糞便基因組（DP328）DNA 提取試劑盒、Axygen DNA 凝膠回收試劑盒 北京天根生化科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 上海源葉生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）、10%中性福爾馬林溶液 北京索萊寶技術(shù)有限公司；三氟乙酸 中國賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

MS204S 型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；單煎機(jī) 青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司；SFTDL 型低速臺式大容量離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；TG16 型臺式高速離心機(jī) 湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；524G 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器有限公司；GZX 型鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Alpha 1-4 LDplus 型冷凍干燥機(jī) 德國Christ 公司；Essentia LC-16 島津高效液相色譜儀 蘇州創(chuàng)譜科學(xué)儀器有限公司；EG1150H 型病理包埋機(jī)、RM2255 型病理切片機(jī) 德國Leica 公司；752N 型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；IX53 型奧林巴斯熒光顯微鏡 北京新愛紡醫(yī)療器械有限公司；NanoDrop1000 型超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific 公司；NDA701 杜馬斯定氮儀 意大利VELP 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參多糖的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[19]中的方法，將500 g 的干燥西洋參切成1 cm 左右的小段后，浸泡在8 L 去離子水中2 h，單煎機(jī)煮沸提取4 h 后，120 目紗布過濾。所得濾渣再重復(fù)提取2 次，每次2 h，合并3 次所得提取液，用單煎機(jī)將其濃縮至1.5 L。濃縮液4500 r/min，離心10 min，取上清液。向上清液中加入4 倍體積的無水乙醇醇沉，靜置6 h以上，然后4500 r/min，離心10 min，取沉淀。將沉淀復(fù)溶于800 mL 去離子水中，靜置后4500 r/min，離心10 min，再次取上清液。向上清液中加入4 倍體積的無水乙醇醇沉，靜置12 h 以上，然后4500 r/min，離心10 min，取沉淀。將沉淀復(fù)溶于800 mL 去離子水中，Sevag 法（三氯甲烷:正丁醇=4:1）脫蛋白三次。收集多糖溶液層，加入無水乙醇至乙醇終濃度為80%，4500 r/min，離心10 min，取沉淀，真空冷凍干燥得西洋參多糖（WQP）。

西洋參多糖產(chǎn)率計算公式如下：

式中：m0表示制備前干燥西洋參質(zhì)量，g；m1表示制備后干燥西洋參多糖質(zhì)量，g。

1.2.2 總糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[20]。以0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 轉(zhuǎn)于試管中，加去離子水補(bǔ)足至總體積1 mL，每個濃度重復(fù)三個樣品，分別向每只試管中加入6%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，迅速混合均勻。室溫反應(yīng)30 min，在490 nm 波長下進(jìn)行掃描。以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品液的配制：稱取WQP 樣品配制為0.1 mg/mL的多糖溶液，取0.6 mL，加去離子水補(bǔ)足至1 mL，后續(xù)操作同標(biāo)準(zhǔn)品的處理方法。

1.2.3 糖醛酸含量測定 采用D-半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[20]。以0.1 mg/mL的D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)液，分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL 轉(zhuǎn)于玻璃試管中，加去離子水補(bǔ)至0.4 mL，每個濃度重復(fù)三個樣品，分別向每只試管中加入氨基磺酸試劑40 μL，搖勻，再加入濃硫酸2.5 mL，迅速混合均勻。沸水浴反應(yīng)20 min，冷卻至室溫后，再加入間羥基聯(lián)苯試劑40 μL，充分振蕩均勻，室溫放置15 min，在550 nm 波長下測定吸光度A。以D-半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品液的配制：稱取WQP 樣品配制為0.1 mg/mL的多糖溶液，取0.4 mL，后續(xù)操作同標(biāo)準(zhǔn)品的處理方法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計算WQP 中的糖醛酸含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定 采用杜馬斯燃燒法測定蛋白質(zhì)含量[21]。準(zhǔn)確稱取WQP 干粉樣品，用錫箔紙包好，壓縮空氣制樣完成后，置于自動進(jìn)樣盤里，在燃燒反應(yīng)器溫度1020 ℃以上、還原反應(yīng)器溫度650 ℃以上、氦氣（純度≥99.99%）壓力2 bar 以上、氧氣（純度≥99.99%）壓力2.5 bar 以上、氮?dú)猓兌取?9.99%）壓力達(dá)到3 bar 以上時自動進(jìn)樣檢測。WQP 樣品做3 個平行檢測，結(jié)果取平均值。

1.2.5 單糖組成測定 樣品的制備：采用PMP 衍生-高效液相色譜法（PMP-HPLC）對WQP 樣品的單糖組成進(jìn)行測定[20,22?24]。稱取2 mg 多糖樣品，進(jìn)行完全酸水解，加入2 mol/L 鹽酸甲醇溶液0.5 mL，充N2封管，80 ℃水解16 h，空氣吹干后，加入2 mol/L三氟乙酸0.5 mL，120 ℃水解1 h，然后移入蒸發(fā)皿，45 ℃水浴，反復(fù)加無水乙醇趕除三氟乙酸后干燥。向水解后的單糖樣品中加入PMP 試劑和0.3 mol/L的NaOH 溶液各0.5 mL，充分溶解后取0.1 mL 水浴70 ℃反應(yīng)30 min 進(jìn)行衍生化，衍生完畢后，加入0.3 mol/L 的HCl 0.05 mL，充分混勻，之后用三氯甲烷萃取3 次，除去PMP。過0.22 μm 的微孔濾膜轉(zhuǎn)移至液相瓶待檢測。

標(biāo)準(zhǔn)品制備：分別稱取2 mg 單糖進(jìn)行衍生化，處理方法同多糖樣品。

色譜條件：Hypersil ODS2 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1 mol/L 82%磷酸鹽緩沖溶液（pH7）和18%乙腈（v/v）；檢測波長245 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速為1.0 mL/min。

1.2.6 動物實(shí)驗(yàn)方案及樣品收集 實(shí)驗(yàn)動物在室內(nèi)溫度為（22±2）℃，相對濕度為55%±5%的飼養(yǎng)環(huán)境中，給予充分的進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)與管理?xiàng)l例。

大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境3 d 后，將24 只大鼠隨機(jī)分為4 組（6 只/組），分別為正常組（C）、抗生素相關(guān)副作用組（DM）、自然恢復(fù)組（NR）和WQP 干預(yù)組（WQP）。DM 組、NR 組和WQP 組大鼠每天上午8:00 和下午16:00 灌胃克林霉素磷酸酯（750 mg/kg），連續(xù)灌胃5 d。C 組給與等量生理鹽水。第6 d，DM 組大鼠異氟烷麻醉。采集血液，1500 r/min 離心10 min，收集血清。打開腹腔，預(yù)冷的生理鹽水沖洗，取盲腸至肛門處腸段。生理鹽水沖洗腸腔，取結(jié)腸組織中間段5～8 cm，10%中性福爾馬林溶液中固定。無菌條件下取糞便樣本（>0.5 g）于無菌凍存管中，?80 °C 冰箱備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠在安樂死箱中安樂死。從第6 d 開始，WQP 組的大鼠灌胃WQP（100 mg/kg），每日兩次，連續(xù)灌胃7 d。C 組和NR 組給與等量生理鹽水。末次給藥12 h 后采集各組大鼠的血清和組織標(biāo)本，處理方式與DM 組相同。

1.2.7 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間每日定時觀察并記錄大鼠的體重變化、精神狀態(tài)和腹瀉情況，評估大鼠腹瀉的嚴(yán)重程度并進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[25]見表1，最后統(tǒng)計各組大鼠得分總和。

表1 腹瀉情況評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Diarrhea scoring criteria

1.2.8 大鼠結(jié)腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察 將固定在10%中性福爾馬林溶液中的結(jié)腸組織取出放于包埋盒中，經(jīng)酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、橫斷切片（厚5 μm）、貼片和烤片等步驟得到切片，隨后進(jìn)行常規(guī)HE 染色，然后封片，晾干后利用奧林巴斯熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.2.9 大鼠腸道細(xì)菌總DNA 提取和Illumina 高通量測序 細(xì)菌基因組總DNA 樣本的提取使用糞便DNA 提取試劑盒，將提取的DNA 于?20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎贸⒘糠止夤舛扔媽NA 進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。對細(xì)菌16S rRNA 的V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，前引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），后 引物806R（5'-TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳后切下目的基因條帶，DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，并對PCR 擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫。采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上進(jìn)行定量，對合格的文庫上機(jī)進(jìn)行高通量測序。大鼠糞便樣本送到上海派森諾生物科技有限公司，基于16S rRNA 測序進(jìn)行腸道菌群多樣性分析。

1.2.10 生物信息學(xué)和統(tǒng)計分析 主要采用 QIIME2（2019.4）軟件和R 軟件（v3.2.0）進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析。對獲得的序列按相似度進(jìn)行歸并、ASV（amplicon sequence variants）/OTU（operational taxonomic units）劃分和聚類分析。根據(jù)ASV 特征序列/OTU 代表序列聚類的稀疏曲線，分析計算α多樣性指數(shù)中的Shannon 指數(shù)以比較樣品間的豐富度與均勻度。對不同處理組菌群的β多樣性進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)，以描述樣本間的自然分布特征。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0 和SPSS24.0 對本文各組數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA（Tukey test）分析，P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 WQP 的產(chǎn)率及單糖組成

以西洋參根干品計，WQP 的產(chǎn)率為6.71%，總糖含量為85.2%，糖醛酸含量31.9%，蛋白質(zhì)含量2.1%。單糖組成分析結(jié)果見圖1，WQP 主要由葡萄糖Glc（33.2%）、半乳糖Gal（8.9%）、阿拉伯糖Ara（12.2%）和半乳糖醛酸GalA（43.9%）組成，還含有少量的鼠李糖Rha（1.8%）。

圖1 HPLC 單糖組成分析Fig.1 Monosaccharide composition analysis by HPLC

2.2 對大鼠一般情況的影響

克林霉素磷酸酯灌胃3 d 后，大鼠開始出現(xiàn)不同程度的腹瀉，表現(xiàn)為活動減少、不活潑、精神狀態(tài)不佳、飲水量增加、排便次數(shù)增多等癥狀，并隨給藥時間延長而加重，嚴(yán)重者可見肛門處紅腫并有少量稀糞便黏附?？肆置顾亓姿狨ス辔傅?～5 d，所有模型動物均出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，糞便變?yōu)槊黠@的稀濕軟，精神萎靡，表明已成功建立了腹瀉模型，見圖2。第6 d 開始進(jìn)行自然恢復(fù)或WQP 干預(yù)，隨著給藥時間延長，NR 組和WQP 組大鼠腹瀉有所緩解。到給藥第7 d，WQP 組大鼠無腹瀉情況出現(xiàn)；NR 組仍有個別大鼠出現(xiàn)腹瀉。從腹瀉情況評分來看，NR 組腹瀉恢復(fù)情況不如WQP 組恢復(fù)情況明顯。

圖2 大鼠腹瀉情況評分Fig.2 Diarrhea scores of rats

2.3 結(jié)腸組織的病理學(xué)結(jié)構(gòu)分析

各組結(jié)腸切片見圖3。C 組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，腸黏膜上皮表面的微絨毛排列整齊，杯狀細(xì)胞豐富。DM 組大鼠的結(jié)腸絨毛變短、稀疏，上皮細(xì)胞排列紊亂，絨毛間質(zhì)水腫現(xiàn)象明顯，隱窩變淺。NR 組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)較DM 組稍有恢復(fù)。與NR 組相比，WQP組大鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)恢復(fù)情況良好，腸絨毛排列更為修長、整齊、致密，隱窩加深，絨毛間質(zhì)水腫現(xiàn)象減弱，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，整體與C 組大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)非常接近。因此，WQP 可以改善克林霉素磷酸酯所造成的結(jié)腸組織損傷，恢復(fù)腸道結(jié)構(gòu)完整性。

圖3 結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的變化（HE，×40）Fig.3 Histopathology observation of colon structure (HE,×40)

2.4 腸道菌群多樣性及組成

2.4.1α和β多樣性分析 各組大鼠腸道中的細(xì)菌16S rRNA 測序后，對獲得的序列進(jìn)行歸并和ASV/OTU 劃分。使用QIIME2 軟件分析，α多樣性指數(shù)中Shannon 指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。對不同處理組菌群的Shannon 多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4A。與C 組相比，DM 組的Shannon多樣性指數(shù)高度顯著降低（P<0.001）。經(jīng)過自然恢復(fù)或WQP 干預(yù)后，腸道菌群的豐富度和多樣性顯著恢復(fù)（P<0.05）。使用R 軟件對不同處理組菌群的β多樣性進(jìn)行PCoA 分析，結(jié)果見PCoA 主坐標(biāo)分析二維排序圖4B?；赨nweighted Unifrac 算法的PCoA分析表明，DM 組樣本與C 組代表樣本的點(diǎn)明顯分開，表明造模后大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。NR 組和WQP 給藥組大部分代表樣本的點(diǎn)聚集在一起，說明菌群組成和結(jié)構(gòu)比較相似。

圖4 腸道菌群α 和β 多樣性分析Fig.4 α and β Diversity analysis of the gut microbiota

2.4.2 腸道菌群的組成分析 16S rRNA 測序后，根據(jù)ASV/OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果，分析了門水平腸道菌群（相對豐度>1%）的相對豐度變化，見圖5。不同處理組腸道菌群組成的相對豐度發(fā)生了顯著的變化。結(jié)果表明，在門水平上，各組大鼠腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）等組成，其中厚壁菌門占比最多，其次是擬桿菌門。與C 組相比，灌胃克林霉素磷酸酯后，DM 組大鼠的擬桿菌門的相對豐度增加；厚壁菌門和變形菌門的相對豐度減少。經(jīng)過自然恢復(fù)或干預(yù)后，與NR 組相比，WQP 可降低厚壁菌門和變形菌門的相對豐度，增加擬桿菌門的相對豐度，且在門水平上的組成更接近C 組。

圖5 腸道菌群在門水平上的相對豐度及組成Fig.5 Relative abundance and composition of gut microbiota at phylum level

對大鼠腸道菌群中相對豐度>1%的菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6 和圖7。屬水平上，大鼠的腸道菌群主要由擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、梭菌屬（Clostridium）、布勞特氏菌屬（Blautia）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、糞球菌屬（Coprococcus）和薩特氏菌屬（Sutterella）等組成。與C 組相比，DM 組擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度高度顯著增加（P<0.001）。NR 和WQP 組腸道菌群組成均較DM 組有一定的恢復(fù)，擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度降低。與NR 組相比，WQP 顯著降低擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度（P<0.05）。

圖6 腸道菌群在屬水平上的相對豐度及組成Fig.6 Relative abundance and composition of gut microbiota at genus level

圖7 腸道菌群中擬桿菌屬和梭菌屬的相對豐度變化Fig.7 Changes of relative abundance of Bacteroides and Clostridium in the gut microbiota

3 討論與結(jié)論

抗生素常用來治療感染、炎癥等疾病，AAD 是抗生素治療期間的主要副作用之一，與腸道菌群失調(diào)，炎癥和腸道結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[26?27]。研究采用克林霉素磷酸酯誘導(dǎo)的腹瀉模型來考察西洋參多糖對抗生素相關(guān)副作用，尤其是腹瀉和腸道菌群失調(diào)的作用。腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，而營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用情況是由腸絨毛[28]的狀態(tài)決定的，一般情況下，腸絨毛的長度與吸收能力呈正相關(guān)。通過研究發(fā)現(xiàn)，DM 大鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)明顯受損，腸絨毛變短，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，腸隱窩變淺，整個結(jié)腸呈現(xiàn)疾病相關(guān)的狀態(tài)。利用WQP 干預(yù)后，能夠很好的修復(fù)受損的腸道結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸絨毛長度和密度的增加，恢復(fù)杯狀細(xì)胞數(shù)量，隱窩加深，結(jié)腸的結(jié)構(gòu)也與C 組大鼠更為相似。結(jié)合WQP 對大鼠腹瀉情況評分的影響，可以發(fā)現(xiàn)，WQP 能夠有效抑制抗生素所引起的腹瀉和腸道結(jié)構(gòu)損傷等副作用。

腸道菌群失調(diào)與腹瀉狀態(tài)密切相關(guān)。抗生素本身又對菌群具有一定的清除作用，因此本文還考察了WQP 對腸道菌群多樣性和組成的影響。結(jié)果表明，WQP 能夠恢復(fù)菌群多樣性，促進(jìn)菌群結(jié)構(gòu)修復(fù)至正常狀態(tài)。門水平和屬水平上，腸道菌群組成均發(fā)生了一定的變化。抗生素干預(yù)后，大鼠腸道菌群多樣性下降，厚壁菌門的比例下降，這與以往的研究結(jié)果一致[29]。門水平上，經(jīng)過恢復(fù)或干預(yù)后，與NR 組相比，WQP 組可降低厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的相對豐度，增加擬桿菌門的相對豐度，且在門水平上的組成更接近正常大鼠。屬水平上，與C 組相比，DM組大鼠擬桿菌屬、梭菌屬相對豐度顯著增加；與NR 組相比，WQP 給藥組顯著降低擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度。擬桿菌屬是人和鼠腸道中的正常菌群之一，其含量一般比較穩(wěn)定[30]，正常情況下在宿主的免疫、營養(yǎng)、代謝等方面起重要作用，可改善其腸道環(huán)境，但也是一種潛在的致病菌[31?32]。條件致病菌在正常情況下不致病，參與調(diào)節(jié)宿主正常的生理功能，但在抗生素干擾后會使機(jī)體菌群失調(diào)，導(dǎo)致腹瀉等癥狀[33]。擬桿菌屬、梭菌屬是人和鼠腸道內(nèi)主要的條件致病菌[34?35]，抗生素干擾后，擬桿菌屬、梭菌屬的相對豐度急劇上升，加重了腹瀉情況，而WQP 干預(yù)可有效降低兩種菌的相對豐度。因此，WQP 對克林霉素磷酸酯所造成副作用的緩解，可能與其降低條件致病菌的含量有關(guān)。

據(jù)報道多糖能夠與腸道菌群[36]相互作用，并調(diào)節(jié)腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，硒化香菇多糖能夠提高慢性胰腺炎小鼠擬桿菌門的相對豐度，降低厚壁菌門的相對豐度，同時能提高擬桿菌屬等的相對豐度，調(diào)節(jié)腸道菌群[37]。葛根多糖能夠改善抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠的腸道菌群失調(diào)問題[11]。水溶性紫薯多糖能夠調(diào)節(jié)腸道炎癥引起的菌群多樣性降低，使結(jié)腸炎模型小鼠腸道菌群恢復(fù)到接近正常水平[38]。竹蓀多糖對結(jié)腸炎和炎癥相關(guān)疾病具有潛在的治療作用[39]。因此，許多多糖可以對腸道菌群起到積極的調(diào)節(jié)作用。但目前還未見西洋參多糖與克林霉素磷酸酯或其它類型的抗生素相互作用的文獻(xiàn)報道。本課題組前期研究了人參多糖及其子級份[8,20,25]、五味子多糖[9]、黃芪多糖[10]等在鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂中的作用，并且對腸道的結(jié)構(gòu)、菌群的多樣性和組成都有一定的恢復(fù)效果。其中，人參多糖能夠提高抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠厚壁菌門的相對豐度，降低擬桿菌門、變形菌門和放線菌門的相對豐度[8]。五味子多糖通過提高腹瀉大鼠擬桿菌門和變形菌門的相對豐度，顯著降低厚壁菌門的相對豐度，來改善腹瀉大鼠的癥狀[9]。黃芪多糖能夠增加厚壁菌門的相對豐度，降低擬桿菌門和變形菌門的相對豐度，并通過調(diào)節(jié)腸道菌群的豐富度和多樣性來改善AAD 大鼠的腹瀉狀態(tài)[10]。一方面腸道菌群能夠降解多糖，促進(jìn)機(jī)體對其吸收和利用；另一方面多糖能夠通過增加有益菌，減少有害菌調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，從而改善機(jī)體的健康水平[40]。不同的多糖對腸道菌群有不同的影響，這可能與其單糖組成、精細(xì)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的差異有關(guān)。本研究中與DM 組相比，WQP 組可降低厚壁菌門的相對豐度，增加擬桿菌門的相對豐度，門水平上這一結(jié)果與五味子多糖的研究一致。西洋參多糖WQP 對由抗生素引起的紊亂的腸道菌群具有一定的恢復(fù)、平衡和重建的作用，可以促進(jìn)擬桿菌屬、梭菌屬減少，表明WQP 可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善抗生素致腹瀉大鼠的腸道菌群。雖然西洋參多糖、人參多糖、五味子多糖、黃芪多糖或其他來源的多糖對腸道菌群的平衡機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但我們的研究結(jié)果可為類似研究提供一些數(shù)據(jù)和理論參考。

盡管西洋參多糖對克林霉素磷酸酯所誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂起到了一定的調(diào)節(jié)作用，但也必須看到，本文的結(jié)果具有一定的局限性。本文測序結(jié)果中，C 組、NR 組和WQP 組有部分序列鑒定不到屬水平，其中一部分序列屬于腸桿菌科，另一部分無法確定到屬水平，這可能是由于序列片段長度有限，所能攜帶的信息有限，再加上目前我們物種注釋采用的算法比通用的blast 更嚴(yán)格，準(zhǔn)確率更高，這就使得在屬水平上的鑒定結(jié)果偏少。在以后的研究工作中，我們將會采用更深度的測序方法，來彌補(bǔ)這一研究手段的不足。

綜上所述，WQP 的產(chǎn)率為6.71%，總糖含量為85.2%，糖醛酸含量為31.9%，蛋白質(zhì)含量為2.1%，主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，還含有少量的鼠李糖。動物實(shí)驗(yàn)表明，WQP 可通過促進(jìn)AAD 大鼠腸道結(jié)構(gòu)恢復(fù)，改善腸道菌群豐富度和多樣性，對克林霉素磷酸酯所造成的腹瀉、腸壁結(jié)構(gòu)破壞及菌群失調(diào)等癥狀產(chǎn)生改善作用。