張瑛毓，普布多吉，盧 聰，王鳳忠,

（1.西藏農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏拉薩 850000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）與血液中尿酸水平升高有關(guān)，是常見(jiàn)的代謝性疾病之一。由于體液中尿酸含量超標(biāo)，尿酸單鈉晶體（MSU）會(huì)在關(guān)節(jié)內(nèi)以及關(guān)節(jié)周?chē)纬珊统练e[1]。HUA 不僅是痛風(fēng)、急性關(guān)節(jié)炎、高血壓、尿酸性腎病和高脂血癥、糖尿病等的重要生化基礎(chǔ)，而且還與中風(fēng)、冠心病和心力衰竭等多種心血管疾病密切相關(guān)[2]。近年來(lái)，隨著生活水平的提高和高蛋白飲食的增加，人們的尿酸水平呈上升趨勢(shì)[3]。流行病學(xué)證據(jù)表明，HUA 的普遍化已經(jīng)成為一種亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4]。

盡管當(dāng)前用于治療高尿酸血癥的化學(xué)藥物可以快速有效緩解患者的癥狀，但這些化學(xué)藥物具有潛在的副作用[5]，其中還包括許多不良反應(yīng)，可導(dǎo)致不同程度的肝損害，神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)和其它副作用，因此，有必要尋找更有效，更安全的藥物來(lái)治療高尿酸血癥和痛風(fēng)[6]。由于食藥材具有安全性高、來(lái)源廣、種類(lèi)多、綜合療效好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[7]，已成為研究降尿酸活性成分的新熱點(diǎn)。在本研究中，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研[8]，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，選取了在傳統(tǒng)應(yīng)用中具有清熱利濕，活血化瘀，利尿補(bǔ)虛功效的15 種常見(jiàn)的食藥材。

常用于篩選降尿酸活性成分的方法分為兩種：體外和體內(nèi)篩選法。常用的體外篩選方法主要是篩選黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制劑，而體內(nèi)篩選方法是通過(guò)建立高尿酸血癥動(dòng)物模型進(jìn)行篩選[9]。因此，首先根據(jù)XOD 活性抑制，對(duì)15 種食藥材是否具有降尿酸功效進(jìn)行了體外篩選，然后通過(guò)斑馬魚(yú)高尿酸血癥模型進(jìn)一步對(duì)其降尿酸活性進(jìn)行驗(yàn)證，為揭示這些食藥材降尿酸功效以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為未來(lái)降尿酸活性成分的快速篩選提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AB 品系野生型斑馬魚(yú) 飼養(yǎng)條件：pH7.0～7.6，水溫27.5～29 ℃，晝夜光照控制為14 h:10 h，每天喂食豐年蝦兩次，斑馬魚(yú)胚胎孵育在28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中；本試驗(yàn)使用食藥材見(jiàn)表1 來(lái)自西藏和北京同仁堂中藥店；氧嗪酸鉀（PO）、黃嘌呤、黃嘌呤鈉鹽（XSS）、黃嘌呤氧化酶（X1875）、別嘌呤醇（APL） 美國(guó)Sigma 公司；Amplex? Red 尿酸/尿酸酶檢測(cè)試劑盒 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；其余試劑 均為分析純。

表1 15 種食藥材信息Table 1 List of edible herbs used in this study

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng) 上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Multiskan GO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 Thermo Fisher 公司；S-18KS 型手持微量電動(dòng)組織勻漿器 萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-600DV 數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食藥材提取物的制備 各種食藥材粉碎成粗粉，稱(chēng)取5.0 g，10 倍量75%乙醇，超聲提取兩次（40 ℃，40 min，480 W，40 kHz），抽濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（40 ℃），氮?dú)鈸]干，分別得到各種食藥材提取物。每種提取物分別用乙醇和水復(fù)溶，得到乙醇提取物醇溶液和水溶液。

1.2.2 基于XOD 活性抑制的體外降尿酸食藥材篩選 以黃嘌呤為底物，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)15 種食藥材XOD 抑制活性。反應(yīng)設(shè)置：空白組、酶反應(yīng)組、抑制劑組、對(duì)照組，每組總體積為200 μL。分組及劑量見(jiàn)表2。將提取物醇溶液和50 μL 黃嘌呤共孵育5 min后，加入50 μL XOD 引發(fā)反應(yīng)（XOD 需要在37 ℃下預(yù)孵30 min 以穩(wěn)定酶活），混合均勻，37 ℃，295 nm測(cè)定吸光度，所有測(cè)定均重復(fù)三次。本試驗(yàn)以APL 作為陽(yáng)性對(duì)照。

表2 分組及劑量Table 2 Grouping and dosage

式中：A1、A2、A3、A4 分別代表酶反應(yīng)組、空白組、抑制劑組和對(duì)照組在295 nm 處的吸光度。

1.2.3 基于斑馬魚(yú)HUA 模型的體內(nèi)降尿酸食藥材篩選

1.2.3.1 構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型給藥劑量的選擇 斑馬魚(yú)HUA 模型構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[25]，簡(jiǎn)述如下：通過(guò)PO+XSS 水溶給藥浸泡5dpf（5days post fertilization，即受精后5 d 斑馬魚(yú)，28.5 ℃孵育24 h 后檢測(cè)斑馬魚(yú)尿酸水平變化，以模型組與空白組相比尿酸含量顯著升高作為建模成功的指標(biāo)。

隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚(yú)于4 個(gè)6 孔板中，分成8組，每組三個(gè)復(fù)孔（40 尾/孔），每孔容量4 L?？瞻捉M：給予等量斑馬魚(yú)培養(yǎng)用水；模型組PX2：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS；模 型 組 PX4：400 μmol/L PO+20 μmol/L XSS；模 型 組 PX6：600 μmol/L PO+30 μmol/L XSS；模 型 組 PX8：800 μmol/L PO+40 μmol/L XSS；模型組PX10：1 mmol/L PO+50 μmol/L XSS；模 型 組 PX20：2 mmol/L PO+100 μmol/L XSS；模 型 組PX40：4 mmol/L PO+200 μmol/L XSS。每組水溶給藥浸泡斑馬魚(yú)24 h后，測(cè)定斑馬魚(yú)尿酸水平變化，選擇與空白組相比尿酸水平顯著升高的濃度作為構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型給藥劑量。

1.2.3.2 每種食藥材給藥劑量的選擇 隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚(yú)于2 個(gè)6 孔板中，分成6 組，每組三個(gè)復(fù)孔（60 尾/孔），每孔容量4 mL。6 組：1000、500、100、50、20、10 μg/mL 提取物水溶給藥浸泡斑馬魚(yú)，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，記錄各組死亡率。

1.2.3.3 基于斑馬魚(yú)高尿酸模型的體內(nèi)降尿酸食藥材篩選 構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型，對(duì)具有良好XOD抑制活性的食藥材做進(jìn)一步降尿酸活性驗(yàn)證。隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚(yú)于6 孔板中，每組三個(gè)復(fù)孔（40 尾/孔），每孔容量4 mL。空白組：等量斑馬魚(yú)培養(yǎng)用水；模型組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS；食藥材給藥組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+不同濃度提取物（每種食藥材的給藥劑量根據(jù)1.2.2.1 的結(jié)果確定）；陽(yáng)性對(duì)照組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+APL 2 mmol/L。除空白組外，其余組先用PO 和XSS 處理斑馬魚(yú)，然后加入相應(yīng)劑量的APL 和食藥材提取物，每組均為水溶給藥浸泡斑馬魚(yú)，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，測(cè)定尿酸水平。

1.2.3.4 斑馬魚(yú)尿酸含量測(cè)定 28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，收集斑馬魚(yú)于1.5 mL EP 管中，吸凈EP 管中的液體，加入40 μL PBS，使用手持勻漿器將收集到的斑馬魚(yú)勻漿破碎，直至無(wú)明顯組織碎塊，15000×g，4 ℃，離心15 min；使用Amplex? Red 尿酸/尿酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定斑馬魚(yú)尿酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（d）表示。采用方差分析和t 檢驗(yàn)來(lái)確定其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇粗提物對(duì)XOD 活性的體外抑制

XOD 是催化嘌呤代謝最后兩個(gè)步驟的關(guān)鍵酶，該酶會(huì)增加血液中尿酸的積累，抑制XOD 活性可以阻斷次黃嘌呤向黃嘌呤和黃嘌呤向尿酸的轉(zhuǎn)化，從而有效降低血清尿酸水平，達(dá)到預(yù)防和治療高尿酸血癥的目的[26]，在長(zhǎng)期的研究中，XOD 已成為治療HUA的重要靶標(biāo)。新型XOD 抑制劑的開(kāi)發(fā)在HUA 治療領(lǐng)域具有廣闊的前景，因此，本研究以XOD 為體外篩選的靶標(biāo)，對(duì)15 種食藥材的降尿酸活性進(jìn)行了體外初步篩選。

如表3 所示，15 種食藥材的乙醇粗提物均具有XOD 抑制活性，其中有8 種在濃度400 μg/mL 時(shí)抑制率達(dá)到50%以上，這8 種食藥材分別是紅景天、兔耳草、牡丹皮、敗醬草、黃柏、綠蘿花、決明子和雪菊，其中紅景天XOD 抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為（140.96±2.76）μg/mL。在測(cè)定條件下，陽(yáng)性藥物APL 的IC50值為6.769 μg/mL。

表3 15 種食藥材XOD 抑制率及IC50 值Table 3 Percentage of XOD inhibition and IC50 value of 15 edible herbs

2.2 構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型給藥劑量的選擇

如圖1 所示，水溶給藥PO+XSS 浸泡斑馬魚(yú)24 h 后，測(cè)定斑馬魚(yú)尿酸水平變化，以模型組與空白組相比尿酸含量出現(xiàn)顯著升高作為建模成功的指標(biāo)。結(jié)果顯示PX2、PX4 和PX6 處理組尿酸水平顯著高于空白組（P<0.001 或P<0.01），其中，PX2 處理組尿酸含量最高，斑馬魚(yú)存活率100%，此濃度下能夠成功構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS作為構(gòu)建斑馬魚(yú)HUA 模型給藥劑量。

圖1 不同處理組尿酸濃度變化Fig.1 Concentration of uric acid in different treatment groups

斑馬魚(yú)基于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，不僅被應(yīng)用于遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，而且已經(jīng)擴(kuò)展到疾病模型和活性物質(zhì)篩選領(lǐng)域。通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)，遺傳學(xué)和其他方法，研究人員創(chuàng)建了一系列可用于活性物質(zhì)篩選的斑馬魚(yú)人類(lèi)疾病模型[27]。通過(guò)構(gòu)建斑馬魚(yú)高通量活性成分篩選平臺(tái)，斑馬魚(yú)已被廣泛用于食藥材活性成分和天然化合物的篩選[28]。在之前的工作中，已經(jīng)成功地構(gòu)建了斑馬魚(yú)高尿酸血癥模型[25]，該模型可以進(jìn)行高通量的食藥材篩選，基于此使用斑馬魚(yú)高尿酸血癥模型來(lái)篩選具有降尿酸功效的食藥材。與現(xiàn)有的動(dòng)物高尿酸血癥模型相比，篩選時(shí)間大大縮短，篩選效率提高。

2.3 每種食藥材給藥劑量的選擇

表4 統(tǒng)計(jì)了8 種食藥材不同濃度乙醇提取物水溶液浸泡給藥24 h 后，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的死亡率。以此作為體內(nèi)篩選時(shí)給藥劑量的選擇依據(jù)。紅景天選擇一個(gè)濃度劑量組：10 μg/mL；牡丹皮選擇兩個(gè)濃度劑量組：10、20 μg/mL；綠蘿花選擇三個(gè)濃度劑量組：10、20、50 μg/mL；決明子選擇三個(gè)濃度劑量組：20、50、100 μg/mL；雪菊、兔耳草、敗醬草、黃柏三個(gè)濃度劑量組：50、100、500 μg/mL。

表4 不同濃度給藥組斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率（%）Table 4 Mortalities of zebrafish larvae at different concentrations (%)

2.4 乙醇粗提物對(duì)HUA 模型斑馬魚(yú)尿酸水平的影響

在對(duì)15 種食藥材體外XOD 抑制活性驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，對(duì)8 種體外抑制效果明顯的食藥材乙醇粗提物的降尿酸活性做進(jìn)一步驗(yàn)證。空白組、模型組、食藥材給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組水溶給藥浸泡斑馬魚(yú)，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，對(duì)各處理組的尿酸水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。藥物處理24 h 后，模型組尿酸水平與空白組相比顯著升高（P<0.01），表明模型建立成功。除空白組外，紅景天組，兔耳草低中高劑量組，牡丹皮高劑量組，敗醬草低中劑量組，黃柏中高劑量組，綠蘿花低中高劑量組，決明子低中高劑量組，雪菊低中高劑量組和APL 組尿酸水平均顯著低于模型組（P<0.05）。除敗醬草和決明子以外，其他6 種提取物對(duì)尿酸水平的影響與濃度呈正相關(guān)，與體外XOD活性抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 8 種乙醇粗提物對(duì)斑馬魚(yú)尿酸水平的影響Fig.2 Effect on uric acid level in zebrafish of 8 edible herbs’ ethanol crude extracts

關(guān)于紅景天、綠蘿花、敗醬草和雪菊的XOD 抑制活性和降尿酸活性研究很少。其中，紅景天和綠蘿花降尿酸效果與陽(yáng)性對(duì)照組APL 非常接近，表明其降尿酸能力更具有明顯的優(yōu)勢(shì)。這四種是典型的傳統(tǒng)藏藥，歷史悠久，具有扎實(shí)的應(yīng)用基礎(chǔ)，對(duì)多種頑固性疾病有良好的療效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這四種中藥具有抗炎、抗菌和抗腫瘤作用，并且對(duì)代謝疾?。ɡ缣悄虿?、高血壓和高脂血癥）的治療也具有一定的作用。這四種中藥在降尿酸藥物的研究中將具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值，其具有降尿酸功效的關(guān)鍵活性化合物也有待進(jìn)一步分離和提取。

3 結(jié)論

通過(guò)體外體內(nèi)相結(jié)合的方法對(duì)15 種食藥材是否具有降尿酸活性進(jìn)行了篩選，為揭示這些食藥材降尿酸功效以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，隨著相關(guān)研究的不斷深入和完善，斑馬魚(yú)高尿酸血癥模型在篩選新的降尿酸活性物質(zhì)方面將具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。此外，隨著關(guān)鍵活性成分的逐漸分離和提取，紅景天、綠蘿花、敗醬草和雪菊在未來(lái)降尿酸產(chǎn)品的研發(fā)中將具有極好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。