劉旭東，張智淮，楊建邦，劉良禹，朱思潔，張玉超，楊 旭

（1.茅臺學(xué)院食品科學(xué)與工程系，貴州仁懷 564507；2.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷 564507；3.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430079）

增塑劑在塑料制品中的質(zhì)量百分比高達3%～30%，它與塑料基質(zhì)之間非共價結(jié)合后極易溢出，從而使人們長期持續(xù)暴露于增塑劑的污染中[1]。作為使用量最大的一類增塑劑，鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）類增塑劑在普通人群中持續(xù)暴露，在特殊人群中的暴露水平甚至可高達20 mg/kg·day[2]，由于具有強烈的內(nèi)分泌干擾作用，對生物體會產(chǎn)生多種毒性，尤其是生殖發(fā)育毒性，目前，PAEs 在全球范圍內(nèi)的使用已受到了嚴(yán)格的限制[3]。因此，非PAEs 類“新型增塑劑”的市場需求日益突出，目前已在多個領(lǐng)域（包括食品領(lǐng)域）均有一定的應(yīng)用[4]。

乙酰檸檬酸三丁酯（acetyl tributyl citrate，ATBC）具有極低的內(nèi)分泌干擾作用，被認為是PAEs 良好的替代物，已在化妝品、玩具、醫(yī)療器具等多個領(lǐng)域被使用，美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)ATBC 可在食品包裝材料和人造調(diào)味品中限量使用[5]。但是與PAEs 類似，ATBC 已經(jīng)被證實可以從包裝材料遷移至不同的產(chǎn)品中，遷移率高的可達79.8 mg/kg，甚至可達到PAEs 的10 倍[6?7]，而隨著ATBC 使用量的繼續(xù)增大，部分人群甚至將受到高水平的ATBC 暴露風(fēng)險。對于ATBC 生殖發(fā)育毒性研究的結(jié)果顯示，ATBC 具有低生殖發(fā)育毒性[7]，而對于其非生殖發(fā)育毒性研究則相對較少。目前對于ATBC 雖然尚無準(zhǔn)確的人群暴露水平報道，但是參考PAEs 增塑劑長期使用后人群的暴露情況以及ATBC 在材料中的高遷移率，未來人們很有可能處于高水平的ATBC暴露中。所以在沒有充分證明其完全安全性的情況下，將其廣泛使用甚至是用于食品領(lǐng)域，無疑冒有巨大的風(fēng)險。

PAEs 類增塑劑非生殖發(fā)育毒性研究結(jié)果顯示，PAEs 暴露除了可以引起強烈的生殖發(fā)育毒性外，還可對實驗動物產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，引起實驗動物行為異常、腦組織病理損傷、氧化應(yīng)激和炎癥水平上升等[8?9]。以此為參考，本研究首先判斷高水平的ATBC暴露是否會導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，隨后探究抗氧化維生素VE對損傷是否具有保護作用，為更全面的評價ATBC 的安全性，確保ATBC 的安全使用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級C57BL/6 小鼠雄性 30 只，6～8 周齡，22±2 g，于湖北省實驗動物研究中心（實驗動物許可證號：SYXK（鄂）2020-0018，動物質(zhì)量合格證編號：42000600038369），飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物房中，小鼠置于無病原專用鼠籠內(nèi)，每天12 h 光照和12 h 黑暗，允許自由進食和飲水。動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃，室內(nèi)相對濕度為50%～70%，保持室內(nèi)安靜，避免強光照，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開始進行灌胃暴露；ATBC（純度>99%）、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlordihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）、硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA） 美國Sigma-Aldrich 公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純；小鼠還原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutast，SOD）活性檢測試劑盒、4-羥基壬烯酸（4-hydroxynoneal，4-HNE）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear transcription，NF-κB）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒 上海藍基生物公司。

ELx800 酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek 公司；Hide Chameleon V 多功能熒光酶標(biāo)儀 芬蘭Hidex 公司；5424R 低溫冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；DP73 顯微鏡 日本Olympus 公司；ANY-MazeTM動物行為學(xué)分析系統(tǒng) 美國Stoeling Co 公司；JLBehv-SD 小鼠跳臺實驗分析系統(tǒng) 上海吉量軟件科技有限公司；Image Pro Plus（IPP）6.0 分析軟件 美國Media Cybernetics 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ATBC 染毒液的配制及暴露 參考PAEs 特殊人群的暴露濃度和ATBC 的高遷移率，以及本研究的前期預(yù)實驗結(jié)果，使用無菌生理鹽水配制20 mg/mL 的ATBC 染毒液，4 ℃保存，暴露組每天使用標(biāo)準(zhǔn)灌胃針按照0.01 mL/g 體重的灌胃比例灌注相應(yīng)濃度的染毒液，使得小鼠實際暴露劑量為200 mg/kg·day[2,6?7]；對照組按照同樣比例灌注無菌生理鹽水；VE保護組在ATBC 暴露同時灌胃VE（200 mg/kg·day ATBC+50 mg/kg·day VE）[10]，每組10 只小鼠，各組均連續(xù)灌胃90 d。在第84～90 d 進行水迷宮實驗（共7 d），在第88～90 d 進行跳臺實驗，隨后進行各指標(biāo)的檢測。

1.2.2 小鼠體重增長和腦指數(shù)測定 所有實驗小鼠在暴露第1 d 稱量體重，記為“初始體重（g）”，在最后一次暴露24 h 后稱量體重，記為“終體重（g）”，小鼠體重增長（g）=終體重（g）–初始體重（g）。最后一次暴露24 h 后取小鼠腦組織，稱量全腦重量（g），腦指數(shù)=全腦重量（g）/初始體重（g）。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗 通過水迷宮試驗對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力變化進行檢測[10]，第84～88 d 為定向航行實驗，主要用來測試小鼠的學(xué)習(xí)能力，通過對比不同暴露組小鼠在水池中找到逃逸平臺所花費的時間，即逃逸潛伏期（Escape latency，EL）來判斷不同組小鼠的學(xué)習(xí)能力強弱。每天對每只小鼠進行3 次訓(xùn)練，記錄每只小鼠的EL。實驗的第89 d 停止實驗，為遺忘期。第90 d 開始空間探索實驗，旨在測定小鼠的記憶能力，撤去逃逸平臺，讓小鼠在迷宮中游滿60 s，記錄小鼠在目標(biāo)平臺象限的時間和進入次數(shù)及游泳軌跡。

1.2.4 跳臺實驗 通過跳臺實驗對不同暴露組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進行檢測[11]。第88～89 d 為訓(xùn)練期，訓(xùn)練時將小鼠輕輕置于金屬網(wǎng)上的木制平臺上，給小鼠2 min 適應(yīng)周圍環(huán)境。2 min 后對金屬網(wǎng)通電（36 V，50 Hz），通電持續(xù)5 min。一旦小鼠跳下平臺就會受到電擊，小鼠通常會再次跳回平臺。通過2 d 的訓(xùn)練，在第90 d 對小鼠的記憶能力進行測定。記錄小鼠從置于平臺開始到第一次跳下平臺所持續(xù)的時間，即潛伏期；以及整個通電過程中小鼠跳下平臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)。

1.2.5 腦組織樣品的制備 在第90 d 暴露24 h 后，用頸椎脫臼法處死子代小鼠，取小鼠全腦組織。每組隨機選擇3 只小鼠全腦置于4 %的多聚甲醛中進行固定，制作組織切片進行病理觀察，其余全腦組織制備腦組織勻漿。將小鼠腦組織置于冷的磷酸鹽緩沖液（pH=7.5）中洗凈，用吸水紙吸干水分，然后放至玻璃勻漿器中，加入冷的磷酸鹽緩沖液制成10 %的組織勻漿，然后在4 ℃下以10000 r/min 離心10 min，腦組織勻漿中蛋白質(zhì)含量采用Lowry 法進行測定[12]，將上清分裝置于?80 ℃冰箱待使用。

1.2.6 腦組織病理切片制作 對子代小鼠腦組織進行石蠟包埋和切片，進行H&E 和Nissl 染色[13]，隨后在顯微鏡下進行切片觀察。對Nissl 染色切片隨機在腦海馬區(qū)隨機選擇5 個視野區(qū)域，使用Image Pro Plus（IPP）6.0 軟件測出Nissl 染色每張切片的光密度值（OD）進行圖像定量分析[14]。

1.2.7 ROS 含量測定 用磷酸鹽緩沖液將1.2.5 中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液稀釋100 倍，采用DCFH-DA 法檢測ROS 含量[15]，利用熒光酶標(biāo)儀在485 nm 激發(fā)光、525 nm 發(fā)射光的條件下測定熒光強度，反映樣品中含有ROS 的水平。

1.2.8 丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量測定 取1.2.5 中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用TBA 法測定MDA 的含量[16]，MDA 能夠與TBA 反應(yīng)縮合形成紅色產(chǎn)物，分別在532、600 和450 nm 波長下測定光吸光收值，按照公式：MDA（μmol/L）=6.45×（OD532?OD600）?0.56×OD450計算MDA 的含量。

1.2.9 4-HEN、GSH 含量測定 取1.2.5 中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用4-HEN、GSH 檢測試劑盒進行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.2.10 SOD 活性測定 取1.2.5 中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，使用SOD 活性檢測試劑盒進行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.2.11 NF-κB、TNF-α和IL-1β含量測定 取1.2.5中制備的子代小鼠腦組織勻漿上清液，用TNF-α和IL-1β測試劑盒進行測定，具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用方差分析（ANOVA）對實驗數(shù)據(jù)的差異性進行檢測，數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖使用GraphPad Prism 8.0（San Diego，美國）生成，用SPSS 13.0（SPSS，美國）分析數(shù)據(jù)。采用多重ANOVA 進行水迷宮定向航行實驗數(shù)據(jù)分析，使用t檢驗確定各暴露組之間的差異性，其他數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA，使用t檢驗分析差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重和腦指數(shù)變化

小鼠體重和腦指數(shù)的變化如圖1 所示。通過90 d的200 mg/kg·day ATBC 連續(xù)暴露，小鼠的體重增長受到了顯著的影響（圖1A）（P<0.05），ATBC 暴露組小鼠體重增長量顯著小于對照組（P<0.05）。而給與VE保護后，ATBC 對小鼠體重增長的影響有明顯緩解，VE保護組小鼠體重增長量和ATBC 暴露組相比有顯著性的提高（P<0.05）。ATBC 暴露對小鼠腦指數(shù)并未產(chǎn)生顯著性影響（圖1B）。

圖1 小鼠體重增長量和腦指數(shù)Fig.1 Mice bodyweight increased and brain index

2.2 水迷宮實驗

水迷宮實驗結(jié)果如表1 和圖2 所示。通過為期5 d 的定向航行訓(xùn)練，各實驗組小鼠的EL 都明顯縮短。在第88 d，暴露組EL 極顯著（P<0.01）高于對照組（表1）。通過第89 d 的遺忘期，第90 d 暴露組小鼠在目標(biāo)平臺象限停留時間及進入次數(shù)極顯著（P<0.01）高于對照組小鼠（圖2A，圖2B）。小鼠的游泳軌跡顯示，對照組小鼠軌跡規(guī)律性較高，相對集中于平臺所在象限，而200 mg/kg·day 暴露組小鼠的游泳軌跡無規(guī)則、無目的性強（圖2C）。給與VE保護后，保護組小鼠EL 和ATBC 暴露組相比顯著性下降（P<0.05），同時目標(biāo)平臺象限停留時間及進入次數(shù)顯著上升，但保護組停留時間依然顯著低于對照組（P<0.05），游泳軌跡規(guī)律性明顯升高。

表1 小鼠逃逸潛伏期（s）Table 1 Escape latency (EL) of offspring mice of each training day (s)

2.3 跳臺實驗

跳臺實驗結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，200 mg/kg·day 暴露組小鼠跳臺潛伏期極顯著性下降（圖3A）而錯誤次數(shù)極顯著上升（圖3B）（P<0.01）。給與VE保護后，保護組小鼠跳臺潛伏期與200 mg/kg·day暴露組小鼠相比顯著性上升（P<0.05），同時錯誤次數(shù)顯著性下降（P<0.05），但仍然顯著高于對照組小鼠的錯誤次數(shù)（P<0.05）。

圖3 跳臺實驗Fig.3 Step-down passive avoidance test

2.4 小鼠腦組織病理學(xué)觀察

圖4 顯示ATBC 暴露之后小鼠腦海馬和大腦皮層組織結(jié)構(gòu)的變化。對照組小鼠腦海馬CA1區(qū)錐體細胞分布均勻，細胞整齊排列，細胞形態(tài)完整，多數(shù)呈多角形，錐體細胞頂狀樹突明顯可見，表現(xiàn)清晰。ATBC 暴露之后，錐體細胞排列松散，混亂，細胞腫脹變圓，頂狀樹突消失（圖4A），還出現(xiàn)了Nissl 染色顏色變淺（圖4C），Nissl 小體數(shù)量極顯著下降（P<0.01，表2）。ATBC 暴露后，大腦皮層細胞雖未出現(xiàn)明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和損傷（圖4B），但神經(jīng)元的數(shù)目發(fā)生了明顯改變，ATBC 暴露組小鼠大腦皮層細胞數(shù)與對照組比，出現(xiàn)了極顯著性的下降（表2）。而VE保護后，保護組和暴露組相比腦海馬CA1區(qū)錐體細胞損傷明顯改善，多數(shù)細胞恢復(fù)正常狀態(tài)，同時Nissl小體數(shù)量也出現(xiàn)了明顯上升，但和對照組相比依然有極顯著的下降（P<0.01）；大腦皮層細胞數(shù)量也顯著增加（P<0.05），但仍然顯著低于對照組（P<0.05）。

圖4 小鼠腦海馬和大腦皮層病理學(xué)觀察（10×40，bar=50 μm）Fig.4 Mice brain histopathological observation of each group (10×40，bar=50 μm）

表2 Nissl 染色OD 值及大腦皮層細胞數(shù)統(tǒng)計Table 2 OD of Nissl staining and cell number of cerebral cortex

2.5 小鼠腦組織氧化應(yīng)激和炎癥水平變化

小鼠腦組織中氧化應(yīng)激和炎癥水平變化如圖5和圖6 所示。ATBC 暴露后小鼠腦組織中ROS 水平極顯著性的升高（P<0.01，圖5A），脂質(zhì)過氧化物MDA 和4-HNE 含量的顯著升高（P<0.05，圖5B、圖5C）。同時小鼠腦組織中GSH 含量和SOD 活性均出現(xiàn)了極顯著性的下降（P<0.01，圖5D、5E）。VE保護以后，保護組和暴露組相比腦組織中ROS、MDA 和4-HNE 含量均出現(xiàn)了顯著下降（P<0.05），但ROS 水平依然顯著性高于對照組（P<0.05）；GSH含量和SOD 活性雖出現(xiàn)了顯著性的上升（P<0.05），但和對照組比仍有顯著性的降低（P<0.05）。圖6 顯示，ATBC 暴露后小鼠腦組織中NF-κb、TNF-α和IL-1β水平均極顯著性的升高（P<0.01）。VE保護以后，保護組和暴露組相比腦組織中NF-κb、TNFα和IL-1β水平雖出現(xiàn)了顯著下降（P<0.05），但仍然極顯著高于對照組（P<0.01）。

圖5 小鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平Fig.5 Oxidative level in mice brain

圖6 小鼠腦組織中炎癥反應(yīng)水平Fig.6 Inflammation level in mice brain

3 討論與結(jié)論

本研究分析了高水平ATBC 暴露后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化和腦組織損傷情況，同時采用VE作為保護劑對損傷進行保護，進一步探究保護效果和損傷機制。本研究結(jié)果顯示，在水迷宮實驗中，ATBC 暴露組小鼠不僅EL 顯著高于對照組（P<0.05），同時在平臺象限停留時間和進入次數(shù)發(fā)生了顯著性的下降（P<0.05），游泳軌跡顯示出盲目性。在跳臺實驗中，ATBC 暴露組跳臺潛伏期顯著下降（P<0.05），而錯誤次數(shù)顯著上升（P<0.05）。腦海馬組織和大腦皮層是認知能力和意識活動的基礎(chǔ)，二者的損傷在PAEs 增塑劑的神經(jīng)毒性研究中均有報道[8?9,14]。本研究的結(jié)果顯示，ATBC 暴露導(dǎo)致了小鼠腦海馬組織椎體神經(jīng)元形態(tài)改變，Nissl 小體含量下降，Nissl 小體缺失提示椎體神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)的合成受到了影響[17]；同時大腦皮層細胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）。腦海馬組織和大腦皮層的損傷無疑會對腦內(nèi)信號的傳遞、記憶的形成造成很大的影響。結(jié)果說明高水平的ATBC 的暴露導(dǎo)致了小鼠學(xué)習(xí)能力記憶的下降和腦組織病理學(xué)損傷。

氧化應(yīng)激是引起機體細胞損傷、死亡的重要機制之一，在PAEs 類塑化劑的毒性研究中已被證實[18?21]。腦作為耗氧量和脂質(zhì)含量高而抗氧化系統(tǒng)薄弱的組織，很容易受到氧化應(yīng)激的影響[22]。體內(nèi)ROS 積累，氧化應(yīng)激水平提高會進一步導(dǎo)致生物大分子損傷[23?24]。根據(jù)氧化應(yīng)激分級模型，持續(xù)的高水平氧化應(yīng)激會進一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，激活炎癥信號通路，例如NF-κB 信號通路，可以將氧化應(yīng)激信號轉(zhuǎn)換成多種細胞內(nèi)活動的信號，其中就包含增加炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達量[25?26]。本研究結(jié)果顯示，高水平的ATBC 暴露會導(dǎo)致小鼠腦組織中ROS 的大量積累，機體氧化應(yīng)激水平上升，脂質(zhì)過氧化物MDA、4-HNE 含量顯著升高（P<0.05），而GSH和SOD 等還原性物質(zhì)的含量/活性則出現(xiàn)了下降。同時，持續(xù)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腦組織中轉(zhuǎn)錄因子NFκb 表達量上升，炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量上升。結(jié)果說明高水平的ATBC 暴露引起了小鼠腦組織氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

細胞內(nèi)的氧化和抗氧化物質(zhì)組成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)機體氧化水平，抗氧化物質(zhì)不光有內(nèi)源性的，還有很多外源性物質(zhì)[27]。VE具有抗氧化特性，易被細胞吸收，且容易從食品、藥品中獲得。本研究的結(jié)果表明，添加外源VE作為保護劑后，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺失有所改善，腦組織病理學(xué)損傷得到緩解，腦組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平均顯著下降（P<0.05）；但是在很多指標(biāo)的檢測中保護組與對照組相比依然具有顯著性的差異（P<0.05）。結(jié)果說明，VE可以通過下調(diào)腦組織氧化應(yīng)激水平對高水平ATBC 暴露誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺失及腦組織損傷進行保護，也提示氧化應(yīng)激是ATBC 暴露誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機制之一。但是在本研究條件下VE并未使損傷完全恢復(fù)到正常水平。

綜上，200 mg/kg·day ATBC 連續(xù)暴露90 d 會誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙、腦組織病理學(xué)損傷，腦組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平顯著上升，而VE可以通過降低腦組織中氧化應(yīng)激水平，進而對ATBC 誘導(dǎo)的損傷進行一定程度的保護。