陳小愛，蔡惠鈿，劉靜宜，湯 釀，陳樹喜，周愛梅,,

（1.華農(nóng)（潮州）食品研究院有限公司，廣東潮州 521021；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；3.廣東展翠食品股份有限公司，廣東潮州 515634）

發(fā)酵食品是微生物酶作用于加工原料使其發(fā)生一系列的生物化學(xué)和物理變化后制成的食品，因風(fēng)味獨(dú)特而受到廣大消費(fèi)者歡迎[1]。老香黃由蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylis）腌制后經(jīng)封壇發(fā)酵而成。新鮮佛手由于口感苦澀辛辣，難以直接食用。為了保留佛手的藥用價(jià)值、改善其口感和延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，自明代以來，嶺南地區(qū)的潮州鄉(xiāng)民以佛手為原料，制作老香黃，其中加配多種中藥材，經(jīng)過鹽腌、曬干、炊熟、浸糖液、浸中藥粉液、曬干等步驟后再封壇發(fā)酵，制成色黑如漆、綿軟的老香黃[2]。老香黃具有消積祛風(fēng)、開胃理氣、化痰生津等功效，而且久藏不壞。此外，老香黃的發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，藥效越佳，價(jià)值也就越高[3]。因此，老香黃是嶺南地區(qū)潮汕家庭必備的藥用涼果，具有良好的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)潛力。

雖然老香黃在嶺南地區(qū)已有悠久加工和食用的歷史，但其深加工水平較低，市售的老香黃加工品僅有蜜餞和茶袋，產(chǎn)品形式單一。且目前關(guān)于老香黃的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道不多，主要集中在相關(guān)工藝、成分及質(zhì)量安全等方面的研究，如劉小青等[4]研究老香黃中礦物質(zhì)含量；王強(qiáng)等[5?6]對(duì)比了老香黃真空冷凍、微波干燥和恒溫?zé)犸L(fēng)干燥工藝，且進(jìn)一步研究老香黃袋泡茶制備工藝；郭守軍等[7]研究了老香黃老藥桔混合沖劑的制備工藝；賴宣等[8]研究了市售23 個(gè)樣品的老香黃亞硝酸鹽和微生物菌落數(shù)含量；劉志聰?shù)萚9]建立了老香黃HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定了橙皮苷和5,7-而甲氧基香豆素的含量；謝璧珠等[10]研究分析了2016 年市售老香黃涼果微生物與食品添加劑的檢測(cè)結(jié)果等；戈子龍等[11]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了老香黃加工前后樣品中細(xì)菌菌群的組成，進(jìn)而挖掘其加工前后微生物組成與老香黃品質(zhì)之間的聯(lián)系。老香黃在加工發(fā)酵過程中風(fēng)味發(fā)生顯著變化，主要體現(xiàn)在其發(fā)酵后產(chǎn)生了令人愉悅且持久的香氣。但在發(fā)酵過程中，老香黃的揮發(fā)性成分究竟發(fā)生了怎樣的變化，目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道。而研究老香黃在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化，可為老香黃的合理開發(fā)利用及其產(chǎn)品控制提供科學(xué)依據(jù)。

基于此，本研究以不同發(fā)酵月份的老香黃為研究對(duì)象，結(jié)合電子鼻、GC-MS 和GC-IMS 這三種技術(shù)在便捷性、質(zhì)譜定性以及靈敏度等方面的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，分析發(fā)酵期間老香黃揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，旨在建立一套監(jiān)測(cè)老香黃揮發(fā)性風(fēng)味成分動(dòng)態(tài)變化的方法，為老香黃在發(fā)酵期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化研究提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老香黃 為同一批生產(chǎn)工藝下常溫密封依次發(fā)酵0、2、4、6、8、12 個(gè)月的樣品，將其分別命名為0M、2M、4M、6M、8M、12M，廣東展翠食品股份有限公司提供。

PEN3 便攜式電子鼻，德國(guó)Airsense 公司；HP6890-5973 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Aglient公司；Flavour Spec 1H1-00053 型氣相離子遷移譜聯(lián)用儀 配有分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）、Reporter 插件、Gallery Plot 插件、GC×IMS Library Search） 德國(guó)G.A.S 公司；固相微萃取手動(dòng)SPME 進(jìn)樣手柄 美國(guó)SUPELCO 公司；75 μm CAR/PDMS 固相微萃取纖維 美國(guó)SUPELCO 公司；四氟乙烯橡膠蓋頂空瓶 廣州市叢源儀器有限公司；AL104 萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及處理 在發(fā)酵期間，老香黃的采樣方式為每次從罐中隨機(jī)選取大小相近的果15～20個(gè)，取回的樣品立即密封置于?20 ℃環(huán)境中保藏。測(cè)試前，每個(gè)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取5 個(gè)果，切碎并混合，再稱取一定的樣品量進(jìn)行充分研磨，立即裝入樣品瓶中待分析。

1.2.2 電子鼻分析 PEN3 型電子鼻由10 種金屬氧化物氣體傳感器陣列組成，性能描述如表1 所示。分析方法參照陳慧等[12]的方法，并稍作修改。精確稱取3.0 g 老香黃于50 mL 橡皮膠墊密封進(jìn)樣瓶中，并在室溫下平衡30 min。隨后插入電子鼻探頭吸取頂端氣體，測(cè)定香氣物質(zhì)。電子鼻參數(shù)：采樣時(shí)間間隔1 s，傳感器清洗時(shí)間為120 s，歸零時(shí)間是10 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間為5 s，傳感器和樣品流量均為400 mL/min，分析采樣時(shí)間為120 s，載氣為空氣，清洗傳感器后進(jìn)樣。檢測(cè)時(shí)傳感器于110 s 后趨于穩(wěn)定，選取111 s為信采集時(shí)間，每種樣品均平行測(cè)定3 次。

表1 PEN3 傳感器性能描述Table 1 PEN3 sensor performance description

1.2.3 GC-MS 分析

1.2.3.1 頂空固相微萃取方法 在頂空固相微萃?。℉eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）之前，先將固相微萃取纖維安裝于手動(dòng)SPME 進(jìn)樣手柄上，于氣相色譜進(jìn)樣口260 ℃老化20 min。通過單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)HS-SPME 的纖維材料、提取溫度、樣品量和萃取時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳提取工藝。然后將老香黃用研磨儀研碎后密封，精確稱取6.0 g 樣品于30 mL 萃取瓶中，蓋上帶有四氟乙烯膠墊的瓶蓋，固定于70 ℃的恒溫磁力攪拌器上，待樣品平衡15 min，將已活化后的固相微萃取針管穿過膠墊，伸出吸附纖維，萃取30 min，隨后將萃取針插入GC 進(jìn)樣口，加熱解析吸附物3 min。

1.2.3.2 GC-MS 分析條件 GC 條件：色譜柱為DBWAX 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為70 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min的速率升高到120 ℃，最后以4 ℃/min 的速率升高到230 ℃，保持5 min；載氣（He）流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，不分流進(jìn)樣。

MS 條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～600。

1.2.4 GC-IMS 分析 頂空進(jìn)樣條件：將2 g 細(xì)磨樣品移入20 mL 頂空玻璃取樣瓶中；頂空孵化溫度60 ℃，孵化時(shí)間15 min，孵化轉(zhuǎn)速 500 r/min，進(jìn)樣體積500 μL，進(jìn)樣針溫度：65 ℃。

GC 條件：色譜柱（FS-SE-54-CB-1 15 m×0.53 mm,1 μm），色譜柱溫60 ℃，運(yùn)行時(shí)間30 min，載氣為高純N2（純度≥99.999%）；載氣流速：起始2.00 mL/min保持 2 min，在2～20 min 線性增至100.00 mL/min，后保持10 min。

IMS 條件：離子源為氚源（6.5 KeV），正離子模式，漂移管長(zhǎng)度9.8 cm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm，漂移氣流速150 mL/min（高純氮?dú)?，純度?9.999%），漂移管溫度45 ℃。以n-酮C4～C9 為外標(biāo)，計(jì)算各化合物的保留指數(shù)（RI）。

1.3 ROAV 計(jì)算

根據(jù)劉登勇等[13]報(bào)道，氣味活度值的計(jì)算可以引進(jìn)一個(gè)參數(shù)ROAV，該參數(shù)設(shè)定對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大成分：ROAVstan=100，其他成分的氣味活度值（A）：

式中：C%A、TA 為各風(fēng)味組分的相對(duì)百分含量和對(duì)應(yīng)的感覺閾值；C%stan、Tstan 分別為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)百分含量和感覺閾值。當(dāng)物質(zhì)的ROAV>1 時(shí)，該物質(zhì)對(duì)于揮發(fā)性風(fēng)味的貢獻(xiàn)大，為主要香氣成分，ROAV 越大，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)就越大；當(dāng)0.1

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用GC-MS 內(nèi)置的NIST08.L 化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)檢測(cè)到的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，用峰面積歸一化法確定各種成分的相對(duì)含量。采用GC-IMS 設(shè)備自帶儀器分析軟件，包括LAV 和插件（Reporter、Gallery plot）對(duì)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行采集和分析，通過保留指數(shù)（RI）和漂移時(shí)間與GC-IMS 文庫以及峰面積歸一化處理進(jìn)行化合物定性定量分析。使用TB tools 軟件繪制聚類熱圖。使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻分析不同發(fā)酵時(shí)間老香黃的揮發(fā)性組分

PEN3 電子鼻系統(tǒng)對(duì)測(cè)量范圍內(nèi)的樣品氣味和揮發(fā)性化合物非常敏感，微小的變化會(huì)導(dǎo)致傳感器響應(yīng)值的差異[14]。由圖1 香氣分布雷達(dá)圖可以看出，對(duì)不同發(fā)酵月份老香黃樣品響應(yīng)強(qiáng)度均較大的傳感器有W2W、W2S、W1W、W1S，它們分別對(duì)芳香成分、醇類、醛酮類、甲基類化合物和有機(jī)硫化物靈敏。不同發(fā)酵月份樣品差異較明顯的體現(xiàn)在W2W、W2S、W1W 上，說明發(fā)酵對(duì)老香黃中的芳香成分、醇類和醛酮類有較大影響。

圖1 不同發(fā)酵月份的老香黃揮發(fā)性成分的電子鼻傳感器響應(yīng)強(qiáng)度雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of aroma components distribution of Laoxianghuang in different fermentation months

在荷載分析圖中，各傳感器的坐標(biāo)可以精準(zhǔn)地反映其對(duì)樣品揮發(fā)性氣味貢獻(xiàn)率的大??；離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，傳感器對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，反之則越小[15]。由圖2 可知，W2W、W2S、W1S 和W1W（分別對(duì)芳香成分、醇類、醛酮類、甲基類化合物和有機(jī)硫化物靈敏）離中心原點(diǎn)較遠(yuǎn)，W1C、W3C、W3S 和W5C（分別對(duì)苯類、氨類、長(zhǎng)鏈烷烴、短鏈烷烴靈敏）次之，距離最近的是W6S 和W5S（分別對(duì)氫化物和氮氧化合物靈敏）。結(jié)合香氣分布雷達(dá)圖說明,芳香成分、醇類、醛酮類、甲基類化合物和有機(jī)硫化物對(duì)老香黃樣品香氣貢獻(xiàn)率最大，而苯類、氨類、長(zhǎng)鏈烷烴、短鏈烷烴次之，貢獻(xiàn)率最小的是氫化物和氮氧化合物。

圖2 不同發(fā)酵月份的老香黃PEN3 傳感器載荷圖Fig.2 PEN3 load diagram of sensor of Laoxianghuang in different fermentation months

由PCA 圖（圖3）可知，總貢獻(xiàn)率為88.4%（PC1和PC2 分別為46.8%和41.6%），說明不同發(fā)酵月份的老香黃樣品間風(fēng)味相互獨(dú)立，整體區(qū)分度較好，PCA 方法適用于老香黃發(fā)酵期間的揮發(fā)性成分分析。發(fā)酵0、2、4 個(gè)月樣品在主成分2 上較為接近，但它們與發(fā)酵6、8、12 個(gè)月樣品差異較大，且發(fā)酵6、8、12 個(gè)月的樣品在主成分1 上均有較明顯的差異，說明總體上發(fā)酵0～4 個(gè)月的老香黃揮發(fā)性組分差異小，而發(fā)酵6～12 個(gè)月樣品的揮發(fā)性組分差異大。由此可見，發(fā)酵6 個(gè)月后老香黃的揮發(fā)性組分開始發(fā)生較大的變化。

圖3 不同發(fā)酵月份的老香黃PCA 圖Fig.3 PCA diagram of Laoxianghuang in different fermentation months

2.2 基于GC-MS 分析不同發(fā)酵時(shí)間的老香黃揮發(fā)性成分

2.2.1 發(fā)酵期間老香黃揮發(fā)性香氣成分的鑒定 不同發(fā)酵時(shí)間的老香黃揮發(fā)性成分的總離子流圖（TIC）如圖4 所示，老香黃在不同發(fā)酵階段共鑒定出46 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括萜烯類、醇類、醛類、酚類、酯類、醚類、雜環(huán)化合物和其它共8 個(gè)種類，具體揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量見圖5 和表2。其中，α-蒎烯（3.87%）、β-蒎烯（2.89%）、月桂烯（3.73%）、萜品油烯（3.75%）、檸檬烯（28.87%）、異松油烯（16.21%）、1-石竹烯（1.66%）、巴倫西亞橘烯（1.11%）、芳樟醇（7.65%）、α-松油醇（1.83%）、糠醛（1.92%）、麥芽酚（7.22%）、茴香腦（1.90%）和2,4-二甲基苯乙烯（1.25%）是不同發(fā)酵時(shí)間的樣品中平均含量較高且相對(duì)穩(wěn)定的14 個(gè)共有成分?；诖?，這些成分可以作為老香黃發(fā)酵期間的目標(biāo)參考化合物。

表2 GC-MS 鑒定不同發(fā)酵時(shí)間老香黃的揮發(fā)性成分Table 2 Identification of volatile compounds in Laoxianghuang by GC-MS

續(xù)表 2

圖4 不同發(fā)酵月份的老香黃TIC 圖Fig.4 TIC diagram of Laoxianghuang in different fermentation months

由圖5 和表2 可知，萜烯類物質(zhì)是老香黃揮發(fā)性成分中含量最豐富的，六個(gè)發(fā)酵階段樣品的萜烯類物質(zhì)的含量分別為68.44%、70.58%、69.92%、67.26%、60.07%和59.8%，且多為單萜烯類化合物；萜烯類化合物具有檸檬香氣、柑橘香、藥草香、木香、青香、花香、甜香等香氣[16,17]。醇類化合物在不同發(fā)酵階段老香黃樣品中的百分含量為15.57%、11.45%、11.96%、13.55%、11.24%、11.06%，醇類物質(zhì)具有木青氣息、花香、薄荷香氣柑橘香、柚香等氣味，（?）-4-萜品醇是在老香黃發(fā)酵期間含量較低但具有不良?xì)馕兜奈镔|(zhì)[18,19]。醛類化合物在不同發(fā)酵階段的老香黃樣品中分別占3.29%、2.91%、4.73%、4.33%、8.22%、7.39，具有焦甜和清新氣味，其中糠醛為主要成分，具有焦香氣味。除此之外，醛類物質(zhì)還具有桂皮、桂肉等芳香[20]。酚類化合物在不同發(fā)酵階段的老香黃樣品中分別占7.71%、6.68%、8.85%、7.84%、10.52%、11.54%，其中麥芽酚為主要成分，具有焦甜香。除此之外，酚類物質(zhì)還具有丁香、辛香和麝香氣味[21,22]。六個(gè)不同發(fā)酵階段老香黃樣品中的酯類物質(zhì)百分含量為0、1.53%、0.67%、2.17%、0.99%、0.8%。該類物質(zhì)有2-糠酸甲酯、3-呋喃甲酸甲酯、肉豆蔻酸異丙酯三種，其中3-呋喃甲酸甲酯具有焦糖香。醚類物質(zhì)是化合物數(shù)量最少的一類，只有茴香腦一種，在發(fā)酵期間的百分含量依次為2.24%、2.82%、2.11%、1.55%、1.05%、1.65%，具有甘草、茴香氣味[23]。六個(gè)發(fā)酵階段老香黃樣品中的雜環(huán)化合物的百分含量分別為1.45%、2.08%、0.63%、1.13%、1.75%、0%，其中2,5-二甲?；秽哂袌?jiān)果香、甜香氣味，2-（羥基乙?；┻秽哂锌煽?、巧克力香。其它類化合物的百分含量在發(fā)酵期間的含量分別為1.3%、1.95%、1.13%、2.17%、6.16%、7.76%，其中桉葉油醇具有薄荷香[24]。綜上所述，萜烯類、醇類、醛類和酚類是老香黃中含量比較豐富的物質(zhì)，其中含量變化最為顯著的是萜烯類、醛類、酚類（P<0.05）。

圖5 不同發(fā)酵月份的老香黃揮發(fā)性成分種類含量圖Fig.5 Proportion of volatile components in Laoxianghuang in different fermentation months

2.2.2 不同發(fā)酵時(shí)間老香黃揮發(fā)性組分變化分析 為了更直觀地對(duì)比不同發(fā)酵時(shí)間老香黃揮發(fā)性成分的差異，采用TB tool 軟件進(jìn)行熱圖聚類分析。如圖6所示，隨著歐氏距離的平方的增加，六個(gè)發(fā)酵時(shí)間段的樣品可分為3 類：0M 和2M、4M 和6M、8M 和12M。結(jié)合圖6 和表2 來看，發(fā)酵0M、2M、4M、6M、8M、12M 六個(gè)樣品的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量分別為27、29、34、37、38、30，呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中以發(fā)酵6 個(gè)月和8 個(gè)月時(shí)最為豐富。從揮發(fā)性成分的含量來看，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，醛類和酚類物質(zhì)總體增加，萜烯類和醇類物質(zhì)逐漸減少，而酯類物質(zhì)從無到有，與黃六斌等[25]研究柑橘酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化趨勢(shì)相似。

分別對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間老香黃中的共有化合物進(jìn)行分析。由圖6 和表2 可知，α-蒎烯含量變化呈降-升-降趨勢(shì)，未發(fā)酵的樣品中含量最高（4.42%），發(fā)酵12 個(gè)月降至最低值（3.09%），據(jù)Vespermann[26]等研究報(bào)道，α-蒎烯在微生物酶的作用下可轉(zhuǎn)化為（?）-4-萜品醇，由此可推測(cè)發(fā)酵期間（?）-4-萜品醇含量的上升可能原因是α-蒎烯的生物轉(zhuǎn)化。β-蒎烯變化呈先下降后上升趨勢(shì)，在發(fā)酵12 個(gè)月時(shí)達(dá)到最大值，為3.64%。月桂烯含量波動(dòng)不大，變化沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性。萜品油烯變化呈先下降后上升的趨勢(shì)，其在未發(fā)酵樣品中的含量最高，在發(fā)酵4 個(gè)月時(shí)含量達(dá)到最低值（2.79%）。檸檬烯為老香黃中含量最高的成分，其在發(fā)酵過程的變化最為顯著（P<0.01），發(fā)酵2 個(gè)月時(shí)檸檬烯含量為34.72%，過了2 個(gè)月后，檸檬烯開始呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵12 個(gè)月樣品中呈現(xiàn)最低值，為22.16%，檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要有1、2、3、6、8 位環(huán)氧化產(chǎn)物，其中6 位環(huán)氧化產(chǎn)物香芹酚在發(fā)酵6 個(gè)月時(shí)含量從無至有，而8 位環(huán)氧化產(chǎn)物α-松油醇含量在發(fā)酵前6 個(gè)月呈上升趨勢(shì)，由此推測(cè)檸檬烯在發(fā)酵期間可能在微生物的作用下發(fā)生了氧化反應(yīng)[27,28]。異松油烯是老香黃揮發(fā)性成分中含量第二高的成分，其變化規(guī)律呈先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵4 個(gè)月時(shí)含量最高，為18.56%，8 個(gè)月時(shí)含量最低（14.03%）。1-石竹烯在未發(fā)酵的樣品中含量很低，但在發(fā)酵2 個(gè)月后含量突然上升，為1.25%，發(fā)酵12 個(gè)月時(shí)則達(dá)到最高值3.75%。巴倫西亞橘烯含量變化沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性，其在未發(fā)酵樣品中的含量最高（2.27%）。芳樟醇的含量較為穩(wěn)定，但未呈現(xiàn)出規(guī)律性。糠醛為多糖的次級(jí)代謝產(chǎn)物[29]，佛手中富含多糖類物質(zhì)[30]，在發(fā)酵8 個(gè)月之前，糠醛含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵8 個(gè)月時(shí)達(dá)到了峰值（2.87%），8 個(gè)月后其含量開始下降，發(fā)酵12 個(gè)月時(shí)含量低至0.9%。麥芽酚在發(fā)酵4 個(gè)月時(shí)含量最高，為8.32%。茴香腦呈升-降-升趨勢(shì)，發(fā)酵2 個(gè)月時(shí)含量最高（2.82%）。2,4-二甲基苯乙烯含量變化沒有呈現(xiàn)規(guī)律，但在發(fā)酵2 個(gè)月時(shí)含量為最高，為1.9%?？傮w而言，α-蒎烯、月桂烯、萜品油烯和巴倫西亞橘烯在老香黃原料中含量最高；β-蒎烯和1-石竹烯在發(fā)酵12 個(gè)月樣品中含量最高；檸檬烯、茴香腦和2,4-二甲基苯乙烯在老香黃發(fā)酵2 個(gè)月時(shí)含量達(dá)到最高；異松油烯、麥芽酚和芳樟醇在樣品發(fā)酵4 個(gè)月時(shí)含量最高；α-松油醇和糠醛分別在發(fā)酵6 個(gè)月和8 個(gè)月時(shí)含量為最高。

圖6 不同發(fā)酵月份的老香黃揮發(fā)性組分聚類分析熱圖Fig.6 Cluster analysis heat map of volatile components in Laoxianghuang in different fermentation months

2.3 基于GC-IMS 分析不同發(fā)酵時(shí)間老香黃的揮發(fā)性成分

2.3.1 發(fā)酵期間老香黃的GC-IMS 二維譜圖分析 采用GC-IMS 技術(shù)分析發(fā)酵期間的老香黃揮發(fā)性成分，圖7 為不同發(fā)酵月份樣品GC-IMS 二維譜圖，縱坐標(biāo)表示GC 保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表反應(yīng)離子峰遷移時(shí)間，橫坐標(biāo)1.0 處豎線為RIP 峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理）。RIP 峰右側(cè)每一個(gè)亮點(diǎn)代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，由于單體離子和中性分子可能在漂移區(qū)形成附屬物，因此一種化合物可能會(huì)產(chǎn)生多個(gè)信號(hào)或點(diǎn)（單體和二聚體，在文中分別以M 和D 表示）[31]。顏色代表物質(zhì)的濃度，顏色越深表示濃度越大。從圖7可以看出，不同發(fā)酵時(shí)間的老香黃揮發(fā)性成分可通過GC-IMS 很好地分離出來，紅框區(qū)域的揮發(fā)性成分在發(fā)酵0 個(gè)月的樣品中含量最低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量逐漸增加。從黃框區(qū)域的揮發(fā)性成分來看，2M、4M 兩個(gè)樣品最相似，6M、8M、12M 樣品存在一定差異。

圖7 不同發(fā)酵月份的老香黃揮發(fā)性組分GC-IMS 二維譜圖Fig.7 GC-IMS two-dimensional spectra of volatile components in Laoxianghuang in different fermentation months

根據(jù)保留指數(shù)（RI）和漂移時(shí)間與GC-IMS 文庫以及峰面積歸一化處理進(jìn)行化合物定性定量分析（表3），定性出38 種已知揮發(fā)性組分，包括萜烯類8種、醇類5 種、醛類9 種、酯類4 種、酮類4 種、酚類1 種、酸類2 種、雜環(huán)類4 種、其它1 種。定性檢出的38 種已知揮發(fā)性組分，大部分是佛手中常見的香味成分，其中，反式-橙花叔醇、庚醛、糠醛、己醛、異戊醛、3-羥基-2-丁酮、2-乙基呋喃、呋喃甲醇、2-乙?；秽葥]發(fā)性成分，目前在佛手的揮發(fā)性組分研究中鮮有報(bào)道，這可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些物質(zhì)一般都具有特殊的香味，比如反式-橙花叔醇具有柑橘、木蘭香氣的氣味；庚醛具有脂肪、柑橘香；糠醛呈焦甜香氣；異戊醛伴有果香；己醛具有類似青草、脂肪氣味；3-羥基-2-丁酮具有黃油、奶油香；2-乙基呋喃伴有堅(jiān)果、脂香等。因此，這些成分構(gòu)成了老香黃特有的氣味（詳情見表3）。

2.3.2 不同發(fā)酵時(shí)間老香黃揮發(fā)性成分離子遷移指紋圖譜分析 為進(jìn)一步比較不同發(fā)酵時(shí)間老香黃揮發(fā)性成分的差異，采用GC-IMS 儀器自帶軟件生成離子遷移指紋圖譜（圖8）。橫軸為樣品中檢測(cè)出的所有揮發(fā)性成分，縱軸為不同發(fā)酵月份的老香黃樣品。將指紋譜圖分為A、B、C、D、E 共5 個(gè)特征峰區(qū)域和F、G 共同區(qū)域。A 區(qū)為發(fā)酵0 個(gè)月樣品的特征峰區(qū)域，包括的揮發(fā)性組分為戊酸乙酯、乙酸丁酯、異戊醛、糠醛。B 區(qū)為發(fā)酵4 個(gè)月樣品的特征峰區(qū)域，包括的揮發(fā)性組分為莰烯、2-丁酮、正丁醛、異戊酸。C 區(qū)為發(fā)酵6 個(gè)月樣品的特征峰區(qū)域，包括的揮發(fā)性組分為己醛、3-羥基-2-丁酮、戊醛、異戊醇、2-乙基呋喃、2-乙?；秽?。D 區(qū)是發(fā)酵8 個(gè)月樣品的特征峰區(qū)域，主要包括反式-橙花叔醇、桉葉油醇、庚醛、乙酸乙酯、2-乙基呋喃、檸檬烯、α-松油醇共8 種揮發(fā)性組分。E 區(qū)為發(fā)酵12 個(gè)月樣品的特征峰區(qū)域，包括的揮發(fā)性組分為β-蒎烯、2,3-丁二酮、4-甲基愈創(chuàng)木酚、壬醛、丙酸。G 區(qū)為發(fā)酵0 個(gè)月和2 個(gè)月的共同區(qū)域，已知的揮發(fā)性組分包括呋喃甲醇、乙醇、反式-β-羅勒烯；F 區(qū)為發(fā)酵8 個(gè)月和12 個(gè)月的共同區(qū)域，包括乙醇、反式-β-羅勒烯、3-蒈烯、α-蒎烯、月桂烯、萜品油烯共6 種揮發(fā)性組分。結(jié)合表3 可知，發(fā)酵前期，呋喃甲醇、乙醇、反式-β-羅勒烯均為最高值；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，三者含量均呈穩(wěn)定的下降趨勢(shì)；而3-蒈烯、α-蒎烯、月桂烯、萜品油烯含量在發(fā)酵前期顯著增加，之后下降，并在發(fā)酵8 個(gè)月后再次升高。2-乙基呋喃、2-乙?；秽?、反式-橙花叔醇隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸增多。這些揮發(fā)性成分的生成可能是由于美拉德反應(yīng)和氨基酸與脂質(zhì)的相互作用有關(guān)[32]。

續(xù)表 3

圖8 不同發(fā)酵月份的老香黃揮發(fā)性組分GC-IMS 指紋圖譜Fig.8 GC-IMS fingerprint of volatile components in Laoxianghuang in different fermentation months

2.4 老香黃揮發(fā)性成分的主要香味貢獻(xiàn)成分

綜合定性結(jié)果，對(duì)每個(gè)階段均檢測(cè)出的化合物香味閾值進(jìn)行查詢并計(jì)算。本研究中檢測(cè)到芳樟醇物質(zhì)，雖然含量較低，但根據(jù)佛手揮發(fā)性風(fēng)味的相關(guān)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，檸檬烯、異松油烯等萜烯化合物和芳樟醇是佛手的重要香氣物質(zhì)。這類物質(zhì)的風(fēng)味閾值低，清香味強(qiáng)烈。故定義芳樟醇的ROAV 為100，其他風(fēng)味成分的ROAV 由式（1）計(jì)算得出。選擇其中ROAV>0.1 的成分列出，如表4 所示。

由表4 可知，ROAV>0.1 有19 種揮發(fā)性成分，對(duì)老香黃的香味有貢獻(xiàn)作用。有12 種物質(zhì)ROAV大于1，這些物質(zhì)分別是芳樟醇、異松油烯、反式-β-羅勒烯、檸檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯、茴香腦、香茅醛、壬醛、己醛-M、己醛-D、3-羥基-2-丁酮、呋喃甲醇，被認(rèn)為是老香黃香氣的關(guān)鍵組分。其中對(duì)老香黃風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的5 個(gè)物質(zhì)分別是香茅醛、壬醛、異松油烯、反式-β-羅勒烯和檸檬烯。關(guān)鍵組分的香氣特征可分為3 大類，第一類是以異松油烯、檸檬烯、茴香腦、香茅醛為代表的，具有明顯檸檬特征的果香和青香；第二類是以壬醛、己醛-M、己醛-D、3-羥基-2-丁酮、呋喃甲醇為代表的，為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物特有的脂香和焦甜香；第三類是以芳樟醇、反式-β-羅勒烯、β-蒎烯、α-蒎烯為代表的，具有強(qiáng)烈萜類物質(zhì)特征的木青氣息、花香和藥草香氣。綜上可知，老香黃的主體香氣為柑橘香、木青氣息、藥草香和焦甜香。

表4 老香黃揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)風(fēng)味活度值Table 4 Relative flavor activity values of volatile flavor components in Laoxianghuang

3 討論與結(jié)論

本文采用電子鼻、GC-MS 和GC-IMS 三種技術(shù)對(duì)老香黃發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分變化進(jìn)行了分析，并結(jié)合相對(duì)風(fēng)味活度值ROAV 評(píng)價(jià)老香黃揮發(fā)性成分對(duì)氣味的貢獻(xiàn)率。電子鼻分析結(jié)果表明，PCA 可有效區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間的老香黃，發(fā)酵0～4 個(gè)月的老香黃揮發(fā)性組分差異小，而發(fā)酵6～12 個(gè)月的揮發(fā)性組分差異大，說明在發(fā)酵6 個(gè)月后老香黃揮發(fā)性組分開始發(fā)生較大的變化。GC-MS 共鑒定出46 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括萜烯類14 種、醇類9 種、醛類6 種、酚類4 種、酯類3 種、醚類1 種、雜環(huán)化合物3 種、其它6 種。α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、萜品油烯、檸檬烯、異松油烯、1-石竹烯、巴倫西亞橘烯、芳樟醇、α-松油醇、糠醛、麥芽酚、茴香腦、2,4-二甲基苯乙烯是發(fā)酵期間含量較高且相對(duì)穩(wěn)定的14 個(gè)共有成分，這些成分可以作為老香黃發(fā)酵期間的目標(biāo)參考化合物。GC-IMS 定性檢出38 種已知揮發(fā)性組分，包括萜烯類8 種、醇類5 種、醛類9 種、酯類4 種、酮類4 種、酚類1 種、酸類2 種、雜環(huán)類4 種、其它1 種。聚類分析和離子遷移指紋圖譜直觀顯示了老香黃的揮發(fā)性成分在發(fā)酵期間發(fā)生了變化，伴有部分物質(zhì)的消失和新物質(zhì)的形成。相對(duì)風(fēng)味活度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，老香黃的主體香氣為柑橘香、木青氣息、藥草香和焦甜香，對(duì)老香黃風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的5 個(gè)物質(zhì)分別是香茅醛、壬醛、異松油烯、反式-β-羅勒烯和檸檬烯。研究發(fā)現(xiàn)，反式-橙花叔醇、庚醛、糠醛、己醛、異戊醛、3-羥基-2-丁酮、2-乙基呋喃、呋喃甲醇、2-乙?；秽葥]發(fā)性組分是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)。這些物質(zhì)成分構(gòu)成了老香黃特有的氣味。