吳夏夢，劉進(jìn)輝，王 英，雷 磊，周展波，王水蓮*，張虹亮*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.長沙市雨花區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410014）

維甲酸（Retinoic Acid，RA）又稱視黃酸，是體內(nèi)存在的具有生物活性的維生素A 衍生物[1]。視黃酸在體內(nèi)具有生物活性的代謝產(chǎn)物主要包括全反式視黃酸（All-trans Retinoic Acid，ATRA）、9-順式視黃酸（9-cis retinoic acid，9-cis-RA）和13-順式視黃酸（13-cis Retinoic Acid，13cRA）3 種[2]。視黃酸具有廣泛的生物學(xué)功能，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖生長、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡及抑制惡性腫瘤細(xì)胞生成等[3-4]。視黃酸結(jié)合蛋白1（Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1，CRABP1）是一種高度保守的細(xì)胞體蛋白[5]，是細(xì)胞液中視黃酸分子與細(xì)胞核上視黃酸核受體互相作用的重要物質(zhì)[6]，其表達(dá)非常廣泛，幾乎存在于各種組織細(xì)胞中。CRABP1基因在各種生物過程中都起著至關(guān)重要的作用[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，CRABP1 可參與胚胎小鼠心臟發(fā)育和小鼠脂肪前體細(xì)胞的分化調(diào)控[8-9]，在食蟹獼猴胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的過程中CRABP1基因表達(dá)增加[10]。這些研究表明CRABP1 可能影響胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化。CARBP1 主要功能是在胞漿中結(jié)合RA，限制其進(jìn)入細(xì)胞核，在微粒體P450 氧化酶的作用下RA 可被氫化為水溶性無活性產(chǎn)物而喪失功能[11-12]。CRABP1 在RA 介導(dǎo)的細(xì)胞分化和增殖過程中起著重要的作用，被認(rèn)為是RA 信號的重要調(diào)節(jié)因子[13-14]。但CRABP1 是否介導(dǎo)了ATRA 影響豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究旨在構(gòu)建豬CRABP1 真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到豬卵泡顆粒細(xì)胞中，進(jìn)一步研究CRABP1 能否介導(dǎo)ATRA 對豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響，為研究CRABP1 在卵泡發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 豬卵巢來自湖南紅星盛業(yè)食品股份有限公司。ATRA 購自Sigma 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、pGEM-T 質(zhì)粒載體購于Promega 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000 購自Invitrogen 公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；DMEM/F12（1X）培養(yǎng)基購自HyClone。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 發(fā)布的相關(guān)編碼區(qū)序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，送往華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 目的基因的擴(kuò)增 用傳統(tǒng)Trizol 法提取豬卵巢RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。

1.4 CRABP1 過表達(dá)載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所用的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1（+），載體圖譜如圖1 所示。

圖1 pcDNA3.1（+）質(zhì)粒圖譜

根據(jù)NCBI 上GenBank 中公布的豬CRABP1mRNA全長序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)引物。上游引物：5'-AAG CTTATGCCCAACTTCGCAGG-3'；下游引物：5'-GAA TTCTCACTCCCGAACATAAATTCT-3'，下劃線指的是HindIII、EcoRI 的酶切位點(diǎn)。

以豬卵巢組織cDNA 為模板，通過設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物與pGEM-T 載體4℃連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基中，37℃正置1 h 后倒置培養(yǎng)過夜。次日，隨機(jī)挑選單克隆菌落于具有氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～14 h，大量擴(kuò)增并小提質(zhì)粒。分別將上述含目的基因質(zhì)粒（pGEM-T-CRABP1）和pcDNA3.1 載體應(yīng)用相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶37℃酶切1 h。電泳后，膠回收酶切產(chǎn)物，利用T4 連接酶將目的片段回收產(chǎn)物與酶切后pcDNA3.1 載體回收產(chǎn)物4℃連接過夜。經(jīng)轉(zhuǎn)化、小提質(zhì)粒、保菌、酶切及測序，確定過表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒大提，并測定其濃度，-20℃保存。

1.5 豬卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) 從屠宰場取卵巢，放入事先預(yù)熱含1% 雙抗生理鹽水中，2～4 h 內(nèi)運(yùn)回試驗(yàn)室，用含1%青鏈霉素預(yù)熱的生理鹽水沖洗干凈。抽吸卵巢上3～6 mm 的卵泡，將卵泡液37℃沉降15 min 后，取上清液1 000 r/min 離心7 min，棄上清，管底沉淀用紅細(xì)胞裂解液37℃處理2 min，1 000 r/min 離心7 min，PBS 洗滌2 遍。將洗滌好的顆粒細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞成熟培養(yǎng)3 d 后，更換新鮮培養(yǎng)基直到細(xì)胞長滿，胰酶消化轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.6 豬卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達(dá)載體qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine TM2 000 說明書進(jìn)行。對于基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%匯合；單獨(dú)轉(zhuǎn)染處理24 h以及轉(zhuǎn)染后添加1 nmol/L ATRA 的豬卵泡顆粒細(xì)胞收樣提取RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；qRT-PCR 檢測CRABP1基因的表達(dá)及凋亡相關(guān)基因XIAP、Bax、Caspase-3、Fas的表達(dá)。

qRT-PCR 反應(yīng)：用ddH2O 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)，根據(jù)CT 值采用2-△△Ct法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。20 μL 反應(yīng)體系：TB Green 10 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），ROS 0.4 μL，cDNA 模版2 μL，加RNase free water 至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，95 ℃終延伸15 s。qRTPCR 反應(yīng)引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 反應(yīng)引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)都獨(dú)立重復(fù)至少3 次以上。兩組之間的差異顯著性比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，3 組以上的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法進(jìn)行檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析都使用SPSS 19.0 軟件程序進(jìn)行分析，0.01＜P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1CRABP1基因的擴(kuò)增與鑒定 以豬卵巢組織cDNA為模板，使用上述引物擴(kuò)增出卵巢CRABP1目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2 所示。擴(kuò)增片段大小約414 bp，與預(yù)計(jì)片段長度相符，膠回收測序結(jié)果與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中豬CRABP1mRNA 比對同源性為99%（圖3）。結(jié)果表明，CRABP1是高表達(dá)于豬卵巢中。

圖2 豬卵巢組織CRABP1 基因 PCR 產(chǎn)物的鑒定

圖3 CRABP1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對結(jié)果

2.2 重組表達(dá)載體的PCR 鑒定與雙酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶對陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別顯示大小約414 bp 的CRABP1條帶和5 428 bp 的pcDNA3.1（+）質(zhì)粒條帶（圖4），其結(jié)果與預(yù)期相符。

圖4 重組表達(dá)載體雙酶切檢測圖

2.3 重組表達(dá)載體的測序鑒定 將重組表達(dá)載體送至華大基因進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果證明CRABP1基因已正確地插入到載體中（圖5），測序結(jié)果與預(yù)期相符。

圖5 CRABP1 過表達(dá)載體酶切測序結(jié)果圖

2.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞qRT-PCR 檢測

2.4.1 CRABP1 過表達(dá)影響豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡 如圖6 顯示，CRABP1 轉(zhuǎn)染豬顆粒細(xì)胞24 h 后，過表達(dá)CRABP1 組CRABP1表達(dá)與pcDNA3.1 空載體組相比極顯著升高；抗凋亡基因XIAP[15]與pcDNA3.1空載體組相比無顯著性變化；促凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、Fas[16]與pcDNA3.1 空載體組相比極顯著升高，表明CRABP1 過表達(dá)對豬顆粒細(xì)胞的凋亡有促作用。

圖6 CRABP1 過表達(dá)對豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響

2.4.2 CRABP1 介導(dǎo)ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡 圖7 表明，pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組與pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組相比，CRABP1的表達(dá)變化不顯著；CRABP1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組CRABP1的表達(dá)極顯著高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組。進(jìn)一步研究顯示，與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組相比，pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組抗凋亡基因XIAP變化不顯著，而pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組促凋亡基 因Bax、Caspase-3、Fas則顯著低于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組；通過先轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達(dá)載體再添加ATRA 后，抗凋亡基因XIAP與促凋亡基因Bax、Caspase-3、Fas的表達(dá)均顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體再添加ATRA 細(xì)胞組。

圖7 CRABP1 介導(dǎo)ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

3 討 論

細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）屬于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白（ILBP）的多基因家族，有2 種高濃度的同源蛋白，分別是CRABP1 和CRABP2，參與視黃酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等功能[8,17-18]。相關(guān)報(bào)道表明，在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中CRABP1缺失可促進(jìn)細(xì)胞生長[19]。CRABP1 通過激活非典型的ERK1/2 凋亡通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[20]。但CRABP1是否參與豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控尚無相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CRABP1能調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞相關(guān)凋亡基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

顆粒細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致發(fā)育期卵泡發(fā)生閉鎖的關(guān)鍵因素[21]。凋亡包括線粒體凋亡途徑和外源性凋亡通路2 個(gè)主要通路，2 種通路最終導(dǎo)致半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族激活，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，致使細(xì)胞凋亡。Bax、Caspase-3、Fas 均是細(xì)胞凋亡信號通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其中Bax 在受到死亡信號的刺激后被激活進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as 是一個(gè)位于細(xì)胞表面誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的跨膜蛋白，而Caspase-3 是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)凋亡[22-24]。本研究結(jié)果顯示，CRABP1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞后，其Bax、Caspase-3、FasmRNA 表達(dá)量均顯著增加。蔣鵬飛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，密蒙花顆粒劑可通過抑制淚腺組織中凋亡因子Bax、Caspase-3、Fas 和FasL 表達(dá)從而抑制淚腺細(xì)胞凋亡；而張坤[26]研究發(fā)現(xiàn)，過量錳可誘導(dǎo)雞腦組織和雞胚神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA 以及FasmRNA 的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA 及Bcl-xmRNA 表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。裴巖巖等[27]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷處理人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞后Bax、Caspase-3mRNA 顯著上調(diào)，Bcl-2mRNA 下調(diào)，表明黃芪甲苷可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡。上述研究表明，通過檢測凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化可直接揭示細(xì)胞凋亡效應(yīng)。細(xì)胞凋亡蛋白X 染色體連鎖抑制劑（XIAP）可控制細(xì)胞在幾種調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡途徑中的存活，可阻斷Caspase 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞逃避凋亡[28-29]。本實(shí)驗(yàn)通過向豬卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達(dá)載體后，檢測出XIAP的表達(dá)與空載體組相比無顯著性變化。以上結(jié)果表明，CRABP1 過表達(dá)可通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。

此外，有研究表明，CRABP1 能夠通過結(jié)合ATRA后參與ATRA 分解代謝[30]。通過轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達(dá)載體至豬卵泡顆粒細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其可抵抗ATRA 對細(xì)胞Bax、Caspase-3、FasmRNA 表達(dá)的抑制作用，這與CRABP1 可介導(dǎo)ATRA 誘導(dǎo)絨山羊毛乳頭細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相一致[31]。當(dāng)轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達(dá)載體后再添加ATRA 也顯著提高了XIAP在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，其原因可能與顆粒細(xì)胞維持體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建豬CRABP1 過表達(dá)載體，并確定其對豬卵泡顆粒細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)；通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CRABP1 可介導(dǎo)ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，提示CRABP1 可能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。