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        從江香豬CAST 基因的組織時(shí)序表達(dá)規(guī)律分析

        2021-06-19 02:34:12張富林楊啟會(huì)孔德順
        中國畜牧雜志 2021年6期
        關(guān)鍵詞:從江嫩度骨骼肌

        張富林,楊 洋,楊啟會(huì),孔德順

        (1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,貴州貴陽 550025;3.貴陽市烏當(dāng)區(qū)新堡鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,貴州貴陽 550025)

        CAST 首次在1964 年被正式認(rèn)定為鈣蛋白酶系統(tǒng)的成員[1],并于1979 年被命名為鈣蛋白酶抑制酶[2],主要在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮功能作用。CAST 是一種內(nèi)源性抑制蛋白,主要作用方式為該蛋白可以通過與被Ca2+激活的鈣蛋白酶的特異性結(jié)合從而抑制蛋白酶的活性[3]。CAST 對(duì)肉質(zhì)的嫩度和風(fēng)味有著重要影響,通過對(duì)鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白活性的調(diào)節(jié)可實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控,在畜禽肌肉組織中,鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解,在肌肉蛋白質(zhì)降解的過程中起到限速的作用,尤其在宰后肌肉嫩度變化中起著關(guān)鍵作用[4]。目前,挖掘肉質(zhì)性狀調(diào)控基因或肉質(zhì)性狀連鎖遺傳標(biāo)記是改良肉用家畜的有效途徑[5],CAST基因在家畜上的研究主要集中在該基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性上[6]。劉香等[7]通過對(duì)72 頭蘇太豬CAST基因的遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)在CAST基因的第6 內(nèi)含子上MspI 酶切位點(diǎn)的3 種基因型間在肌肉的嫩度、pH 值、系水力水平指標(biāo)上均差異顯著。王華[6]等通過對(duì)5 個(gè)綿羊品種CAST基因多態(tài)性及其與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CAST基因可作為綿羊產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)的分子標(biāo)記輔助。以上研究結(jié)果表明CAST基因?qū)倚笕赓|(zhì)性狀具有一定的影響,從江香豬作為貴州優(yōu)質(zhì)的地方資源品種,具備體型矮小、肉質(zhì)香嫩、基因純合、純凈無污染等特點(diǎn),對(duì)于CAST基因在從江香豬組織中的時(shí)序表達(dá)未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)以貴州從江香豬為研究對(duì)象,采用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)從江香豬不同月齡組織中CAST基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析,以期為進(jìn)一步研究CAST基因?qū)慕阖i肉質(zhì)性狀的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 樣本采集 采集1、3、6、9、12 月齡從江香豬的心肌、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪5 個(gè)組織樣本,置于液氮中保存。

        1.1.2 主要試劑 TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇購自莫納生物科技有限公司(珠海);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自百樂科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;瓊脂糖購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

        1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)購自全凈凈化科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自廣州安邦生物科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司;PCR儀購自中康中衛(wèi)(上海)生物科技有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 組織總RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol 法提取樣本總RNA,總RNA 提取完成后,使用紫外分光光度計(jì)對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)完成后使用ddH2O 將其濃度稀釋到同一水平后備用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL:提取的RNA 模板1.5 μL、Primer Mix 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、Ribo Lock RNase Inhibitor 1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、無酶水9.5 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)置為65℃變性5 min,42℃孵育60 min,70℃失活反應(yīng)5 min。

        1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 上豬CAST基因的mRNA 序列(登錄號(hào):NM_214067.1),通過Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并交由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成,引物序列信息見表1。

        表1 CAST 基因引物信息

        1.2.3CAST基因的克隆與檢測(cè) 以從江香豬背最長(zhǎng)肌cDNA 為模板進(jìn)行CAST基因的克隆??寺◇w系20 μL:上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 模板(20 ng/μL)1 μL、DNA 聚合酶10.0 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min,95℃變性35 s,57℃退火30 s,72℃延伸90 s,共35 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

        1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將1.2.1 中獲得的cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系10 μL:SsoFast EvaGreen Supermix 5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 模 板(100 ng/μL)2 μL,ddH2O 2 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s,59.5℃退火30 s,循環(huán)40 次后進(jìn)行熔解曲線分析,以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃。熒光信號(hào)在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè),每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-??Ct方法對(duì)qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行分析,利用SPSS 18.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,P<0.01 表示差異極顯著,P<0.05 表示差異顯著,P>0.05 表示差異不顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1CAST基因CDS 區(qū)的克隆 將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖電泳鑒定,結(jié)果顯示條帶單一,并且與預(yù)期大小一致(圖1)。

        圖1 CAST 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖

        2.2 從江香豬不同時(shí)間段相同組織CAST基因表達(dá)分析 經(jīng)測(cè)序比對(duì),克隆的CAST基因擴(kuò)增結(jié)果與設(shè)計(jì)合成序列一致,且CAST基因內(nèi)參GAPDH基因的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)S 型,拐點(diǎn)清晰,并且熔解曲線均只有一個(gè)峰,說明熒光引物特異性較好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠(圖2)。由圖3 可知,在心臟組織中,CAST基因的表達(dá)量由高到低依次為6、12、9、3、1 月齡(P<0.01)。在肝臟組織中,CAST基因的整體表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)先增高再減少,且在3、6 月齡的表達(dá)量極顯著高于1、9、12 月齡。在骨骼肌中,CAST基因在9 月齡的表達(dá)量最高(P<0.01),12 月齡表達(dá)量極顯著高于6、3、1 月齡,1 月齡和3 月齡表達(dá)量無顯著性差異。在背最長(zhǎng)肌中,CAST基因在9 月齡表達(dá)量最高(P<0.01),6 月齡表達(dá)量極顯著高于12、1、6 月齡,1 月齡和6 月齡表達(dá)量無顯著性差異。在脂肪中,CAST基因在9 月齡表達(dá)量最高(P<0.01),其次由高到低依次為6 月齡、12 月齡、3 月齡、1 月齡,1 月齡極顯著低于其他月齡。

        圖2 CAST 基因和GAPDH 基因的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

        圖3 CAST 基因在相同組織中不同月齡之間的表達(dá)量差異

        2.3 從江香豬相同月齡不同組織中CAST基因的表達(dá)分析 相同月齡不同組織中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果如圖4 所示,在不同月齡的心臟、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪中CAST基因均有表達(dá),說明該基因在從江香豬各組織表達(dá)具有廣譜性。1 月齡時(shí),CAST基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高,極顯著高于其他組織,肝臟中表達(dá)量最低。3 月齡時(shí),CAST基因在心臟中的表達(dá)量最高(P<0.01),背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與骨骼肌無顯著差異,但兩者表達(dá)量均極顯著高于脂肪和肝臟組織,在肝臟中表達(dá)量最低。6 月齡時(shí),CAST基因表達(dá)由高到低為心臟>骨骼肌>背最長(zhǎng)?。局荆靖闻K(P<0.01)。9 月齡時(shí),CAST基因表達(dá)量為骨骼肌>背最長(zhǎng)?。拘呐K>脂肪>肝臟(P<0.01)。12 月齡時(shí),CAST基因表達(dá)量為骨骼?。拘呐K>背最長(zhǎng)?。局荆靖闻K(P<0.01)。

        圖4 CAST 基因在相同月齡不同組織中的表達(dá)差異

        3 討 論

        CAST基因作為一種鈣蛋白酶依賴的特異性抑制劑,廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi),有研究顯示通過對(duì)鈣蛋白酶-鈣蛋白酶抑素系統(tǒng)的活性改變可以調(diào)控肉的嫩度[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CAST基因的mRNA 在從江香豬心臟、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪5 個(gè)組織的不同時(shí)間段均有表達(dá),這一結(jié)果與CAST基因在其他哺乳類及禽類動(dòng)物中的研究結(jié)果相符[9-12],說明CAST基因在家禽及家畜不同組織中的表達(dá)均具有廣譜性,也進(jìn)一步證實(shí)了鈣蛋白酶抑制酶在豬細(xì)胞中是普遍存在的。本研究結(jié)果顯示在幼齡從江香豬各組織中CAST基因的表達(dá)量均不高,但均有表達(dá),這一結(jié)果與李武峰[13]等對(duì)廣靈驢組織中CAST基因的表達(dá)研究一致;隨著年齡的增長(zhǎng),在從江香豬不同年齡段CAST基因在脂肪中的表達(dá)量始終相對(duì)較低,而在心臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著增加。管凇等[13]研究顯示與幼齡階段黑山羊相比CAST基因在成年后的黑山羊心肌、肝臟、骨骼肌中的表達(dá)量顯著增加,但在脂肪中的表達(dá)量始終相對(duì)較低,這與本研究結(jié)果基本一致,說明CAST基因可能在調(diào)控肌肉的剪切力及嫩度方面具有一定作用,同時(shí)也揭示了CAST基因可能會(huì)對(duì)從江香豬肌肉剪切力和嫩度存在調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從江香豬不同月齡各組織間表達(dá)量進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),心臟、骨骼肌和背最長(zhǎng)肌為CAST基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織,這與肖蘞[10]在山地烏骨雞中對(duì)CAST基因的研究結(jié)果一致。本研究顯示在從江香豬3 月齡和6 月齡,CAST基因在各組織中的表達(dá)總趨勢(shì)為心臟>骨骼?。颈匙铋L(zhǎng)?。局荆靖闻K,且各組織間表達(dá)差異極顯著,這與劉安芳[14]報(bào)道的CAST基因在艾維茵祖代肉種雞、寶萬斯尼拉祖代蛋用種雞以及四川大恒家禽育種公司培育的并經(jīng)過四川省品種委員會(huì)審定通過的優(yōu)質(zhì)雞純AB、D 系祖代種雞等品種中的肌肉組織中表達(dá)量顯著高于其他組織的結(jié)果存在差異,可能是實(shí)驗(yàn)品種及所測(cè)定樣品的月齡不同等導(dǎo)致;而在其余時(shí)間段顯示CAST基因在骨骼肌及背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量較高,這一結(jié)果與劉安芳[14]研究結(jié)果相似。Ciobanu 等[15]發(fā)現(xiàn)豬CAST基因與系水力、嫩度、蒸煮損失等肉質(zhì)性狀顯著相關(guān),對(duì)豬肉的pH 影響較小。綜上可知,CAST基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。

        4 結(jié) 論

        結(jié)果表明,CAST基因在不同月齡段不同組織中均有表達(dá),說明CAST 基因表達(dá)具有廣譜性,且在不同月齡段不同組織中表達(dá)量具有差異性,證實(shí)CAST 基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。

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