張富林，楊 洋，楊啟會(huì)，孔德順

（1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550025；3.貴陽市烏當(dāng)區(qū)新堡鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州貴陽 550025）

CAST 首次在1964 年被正式認(rèn)定為鈣蛋白酶系統(tǒng)的成員[1]，并于1979 年被命名為鈣蛋白酶抑制酶[2]，主要在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮功能作用。CAST 是一種內(nèi)源性抑制蛋白，主要作用方式為該蛋白可以通過與被Ca2+激活的鈣蛋白酶的特異性結(jié)合從而抑制蛋白酶的活性[3]。CAST 對(duì)肉質(zhì)的嫩度和風(fēng)味有著重要影響，通過對(duì)鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白活性的調(diào)節(jié)可實(shí)現(xiàn)對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，在畜禽肌肉組織中，鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解，在肌肉蛋白質(zhì)降解的過程中起到限速的作用，尤其在宰后肌肉嫩度變化中起著關(guān)鍵作用[4]。目前，挖掘肉質(zhì)性狀調(diào)控基因或肉質(zhì)性狀連鎖遺傳標(biāo)記是改良肉用家畜的有效途徑[5]，CAST基因在家畜上的研究主要集中在該基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性上[6]。劉香等[7]通過對(duì)72 頭蘇太豬CAST基因的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在CAST基因的第6 內(nèi)含子上MspI 酶切位點(diǎn)的3 種基因型間在肌肉的嫩度、pH 值、系水力水平指標(biāo)上均差異顯著。王華[6]等通過對(duì)5 個(gè)綿羊品種CAST基因多態(tài)性及其與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CAST基因可作為綿羊產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)的分子標(biāo)記輔助。以上研究結(jié)果表明CAST基因?qū)倚笕赓|(zhì)性狀具有一定的影響，從江香豬作為貴州優(yōu)質(zhì)的地方資源品種，具備體型矮小、肉質(zhì)香嫩、基因純合、純凈無污染等特點(diǎn)，對(duì)于CAST基因在從江香豬組織中的時(shí)序表達(dá)未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以貴州從江香豬為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)從江香豬不同月齡組織中CAST基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，以期為進(jìn)一步研究CAST基因?qū)慕阖i肉質(zhì)性狀的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣本采集 采集1、3、6、9、12 月齡從江香豬的心肌、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪5 個(gè)組織樣本，置于液氮中保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇購自莫納生物科技有限公司（珠海）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自百樂科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)購自全凈凈化科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自廣州安邦生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司；PCR儀購自中康中衛(wèi)（上海）生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織總RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol 法提取樣本總RNA，總RNA 提取完成后，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)完成后使用ddH2O 將其濃度稀釋到同一水平后備用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：提取的RNA 模板1.5 μL、Primer Mix 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、Ribo Lock RNase Inhibitor 1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、無酶水9.5 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)置為65℃變性5 min，42℃孵育60 min，70℃失活反應(yīng)5 min。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 上豬CAST基因的mRNA 序列（登錄號(hào)：NM_214067.1），通過Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并交由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 CAST 基因引物信息

1.2.3CAST基因的克隆與檢測(cè) 以從江香豬背最長(zhǎng)肌cDNA 為模板進(jìn)行CAST基因的克隆?？寺◇w系20 μL：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 模板（20 ng/μL）1 μL、DNA 聚合酶10.0 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，95℃變性35 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將1.2.1 中獲得的cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL：SsoFast EvaGreen Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模 板（100 ng/μL）2 μL，ddH2O 2 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，59.5℃退火30 s，循環(huán)40 次后進(jìn)行熔解曲線分析，以每5 s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃。熒光信號(hào)在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-??Ct方法對(duì)qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行分析，利用SPSS 18.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1CAST基因CDS 區(qū)的克隆 將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果顯示條帶單一，并且與預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1 CAST 基因PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.2 從江香豬不同時(shí)間段相同組織CAST基因表達(dá)分析 經(jīng)測(cè)序比對(duì)，克隆的CAST基因擴(kuò)增結(jié)果與設(shè)計(jì)合成序列一致，且CAST基因內(nèi)參GAPDH基因的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)S 型，拐點(diǎn)清晰，并且熔解曲線均只有一個(gè)峰，說明熒光引物特異性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠（圖2）。由圖3 可知，在心臟組織中，CAST基因的表達(dá)量由高到低依次為6、12、9、3、1 月齡（P＜0.01）。在肝臟組織中，CAST基因的整體表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)先增高再減少，且在3、6 月齡的表達(dá)量極顯著高于1、9、12 月齡。在骨骼肌中，CAST基因在9 月齡的表達(dá)量最高（P＜0.01），12 月齡表達(dá)量極顯著高于6、3、1 月齡，1 月齡和3 月齡表達(dá)量無顯著性差異。在背最長(zhǎng)肌中，CAST基因在9 月齡表達(dá)量最高（P＜0.01），6 月齡表達(dá)量極顯著高于12、1、6 月齡，1 月齡和6 月齡表達(dá)量無顯著性差異。在脂肪中，CAST基因在9 月齡表達(dá)量最高（P＜0.01），其次由高到低依次為6 月齡、12 月齡、3 月齡、1 月齡，1 月齡極顯著低于其他月齡。

圖2 CAST 基因和GAPDH 基因的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

圖3 CAST 基因在相同組織中不同月齡之間的表達(dá)量差異

2.3 從江香豬相同月齡不同組織中CAST基因的表達(dá)分析 相同月齡不同組織中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果如圖4 所示，在不同月齡的心臟、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪中CAST基因均有表達(dá)，說明該基因在從江香豬各組織表達(dá)具有廣譜性。1 月齡時(shí)，CAST基因在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織，肝臟中表達(dá)量最低。3 月齡時(shí)，CAST基因在心臟中的表達(dá)量最高（P＜0.01），背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與骨骼肌無顯著差異，但兩者表達(dá)量均極顯著高于脂肪和肝臟組織，在肝臟中表達(dá)量最低。6 月齡時(shí)，CAST基因表達(dá)由高到低為心臟＞骨骼肌＞背最長(zhǎng)?。局荆靖闻K（P＜0.01）。9 月齡時(shí)，CAST基因表達(dá)量為骨骼肌＞背最長(zhǎng)?。拘呐K＞脂肪＞肝臟（P＜0.01）。12 月齡時(shí)，CAST基因表達(dá)量為骨骼?。拘呐K＞背最長(zhǎng)?。局荆靖闻K（P＜0.01）。

圖4 CAST 基因在相同月齡不同組織中的表達(dá)差異

3 討 論

CAST基因作為一種鈣蛋白酶依賴的特異性抑制劑，廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，有研究顯示通過對(duì)鈣蛋白酶-鈣蛋白酶抑素系統(tǒng)的活性改變可以調(diào)控肉的嫩度[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAST基因的mRNA 在從江香豬心臟、肝臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌和脂肪5 個(gè)組織的不同時(shí)間段均有表達(dá)，這一結(jié)果與CAST基因在其他哺乳類及禽類動(dòng)物中的研究結(jié)果相符[9-12]，說明CAST基因在家禽及家畜不同組織中的表達(dá)均具有廣譜性，也進(jìn)一步證實(shí)了鈣蛋白酶抑制酶在豬細(xì)胞中是普遍存在的。本研究結(jié)果顯示在幼齡從江香豬各組織中CAST基因的表達(dá)量均不高，但均有表達(dá)，這一結(jié)果與李武峰[13]等對(duì)廣靈驢組織中CAST基因的表達(dá)研究一致；隨著年齡的增長(zhǎng)，在從江香豬不同年齡段CAST基因在脂肪中的表達(dá)量始終相對(duì)較低，而在心臟、骨骼肌、背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著增加。管凇等[13]研究顯示與幼齡階段黑山羊相比CAST基因在成年后的黑山羊心肌、肝臟、骨骼肌中的表達(dá)量顯著增加，但在脂肪中的表達(dá)量始終相對(duì)較低，這與本研究結(jié)果基本一致，說明CAST基因可能在調(diào)控肌肉的剪切力及嫩度方面具有一定作用，同時(shí)也揭示了CAST基因可能會(huì)對(duì)從江香豬肌肉剪切力和嫩度存在調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從江香豬不同月齡各組織間表達(dá)量進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，心臟、骨骼肌和背最長(zhǎng)肌為CAST基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織，這與肖蘞[10]在山地烏骨雞中對(duì)CAST基因的研究結(jié)果一致。本研究顯示在從江香豬3 月齡和6 月齡，CAST基因在各組織中的表達(dá)總趨勢(shì)為心臟＞骨骼?。颈匙铋L(zhǎng)?。局荆靖闻K，且各組織間表達(dá)差異極顯著，這與劉安芳[14]報(bào)道的CAST基因在艾維茵祖代肉種雞、寶萬斯尼拉祖代蛋用種雞以及四川大恒家禽育種公司培育的并經(jīng)過四川省品種委員會(huì)審定通過的優(yōu)質(zhì)雞純AB、D 系祖代種雞等品種中的肌肉組織中表達(dá)量顯著高于其他組織的結(jié)果存在差異，可能是實(shí)驗(yàn)品種及所測(cè)定樣品的月齡不同等導(dǎo)致；而在其余時(shí)間段顯示CAST基因在骨骼肌及背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量較高，這一結(jié)果與劉安芳[14]研究結(jié)果相似。Ciobanu 等[15]發(fā)現(xiàn)豬CAST基因與系水力、嫩度、蒸煮損失等肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)，對(duì)豬肉的pH 影響較小。綜上可知，CAST基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，CAST基因在不同月齡段不同組織中均有表達(dá)，說明CAST 基因表達(dá)具有廣譜性，且在不同月齡段不同組織中表達(dá)量具有差異性，證實(shí)CAST 基因可能是影響從江香豬肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。